神经递质对豚鼠左心室流出道自律细胞电活动的影响

Acta Physiologica Sinica, October 25, 2005, 57(5): 593-598

研究论文

神经递质对豚鼠左心室流出道自律细胞电活动的影响

赵兰平，张晓云，陈彦静^*，李建东，张三明，王雪芳，葛赋贵

河北北方学院生理教研室，张家口075000

摘要：为研究左心室流出道慢反应自律细胞的神经支配和受体分布，本实验采用标准玻璃微电极细胞内记录技术，分别观测了肾上腺素能和胆碱能受体激动剂及相应的受体拮抗剂对离体豚鼠左心室流出道组织自发慢反应电位的影响。观测指标有：最大舒张电位(maximal diastolic potential, MDP)、动作电位幅度(amplitude of action potential, APA)、0相最大去极速度(maximal rate of depolarization, V_max)、4相自动去极速度(velocity of diastolic depolarization, VDD)、复极50%时间(50% of duration of action potential, APD₅₀)和90%时间(90% of duration of action potential, APD₉₀)以及自发放电频率(rate of pacemaker firing, RPF)。结果表明：(1)100 μmol/L异丙肾上腺素(isoprenaline, Iso)可使RPF 和VDD显著加快(P<0.01)，MDP绝对值和APA显著增大( P<0.05, P<0.01)，V_max加快(P <0.05)，APD₅₀缩短(P<0.01)，这些变化均可被 5 μmol/L心得安拮抗；(2)100 μmol/L肾上腺素(epinephrine, E)可使RPF和VDD加快(P<0.01, P<0.05)，APA显著增大(P<0.001)，V_max加快(P<0.05)，APD₅₀和APD₉₀缩短(P <0.05) ；(3)100 μmol/L去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)可使VDD和RPF加快(P<0.05)，APA显著增大( P<0.05)，V_max明显加快(P <0.05)，APD₅₀缩短(P<0.05)，这些变化可被 100 μmol/L酚妥拉明拮抗；(4)10 μmol/L ACh可使VDD和RPF减慢(P<0.05)，APA显著减小( P<0.01)，APD₅₀缩短(P<0.05) ；ACh对APD₅₀的缩短效应可被10 mmol/L阿托品拮抗(P<0.05)。结果提示：左心室流出道自律细胞膜上可能存在 α-肾上腺素能受体(α-adrenergic receptor, α-AR)、β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor, β-AR)以及M型胆碱能受体(muscarinic receptor, MR)，其自律性电活动可能也接受心交感神经和心迷走神经调控。

关键词：神经递质；豚鼠；心室流出道；电活动

中国分类号：Q463；R331.3

Electrophysiological effects of neurotransmitters on pacemaker cells in guinea pig left ventricular outflow tract

ZHAO Lan-Ping, ZHANG Xiao-Yun, CHEN Yan-Jing^*, LI Jian-Dong, ZHANG San-Ming, WANG Xue-Fang, GE Fu-Gui

Department of Physiology, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China

Abstract: This study was designed to explore the innervation of autonomic nervous system and the distribution of receptors on pacemaker cell membrane in guinea pig left ventricular outflow tract (aortic vestibule). By using conventional intracellular microelectrode technique to record action potentials, autonomic neurotransmitters and antagonists were used to investigate the electrophysiological features and regularities of spontaneous activity of left ventricular outflow tract cells. Electrophysiological parameters examined were: maximal diastolic potential (MDP), amplitude of action potential (APA), maximal rate of depolarization (V_max), velocity of diastolic depolarization (VDD), rate of pacemaker firing (RPF), 50% and 90% of duration of action potential (APD₅₀ and APD₉₀). The results are listed below: (1) Perfusion with 100 mmol/L isoprenaline (Iso) resulted in a significant increase in V_max (P <0.05), VDD, RPF, and APA (P <0.01), a notable decrease in MDP (P<0.05), and also a marked shortening in APD₅₀(P<0.01). Pretreatment with Iso (100 μmol/L), propranolol (5 μmol/L) significantly decreased RPF and VDD (P<0.01), decreased APA, MDP and V_max (P<0.01) notably, prolonged APD₅₀(P<0.01) and APD₉₀(P<0.05)markedly. (2) Application of 100 μmol/L epinephrine (E) resulted in a significant increase in VDD (P<0.05), RPF (P<0.001), V_max (P<0.05) and APA (P<0.001), and a notable shortening in APD₅₀ and APD₉₀(P<0.05). (3) Perfusion with 100 μmol/L norepinephrine (NE) led to a significant increase in VDD, RPF，APA and V_max (P<0.05), and a marked shortening in APD₅₀(P<0.05).Pretreatment with NE (100 μmol/L), phentolamine (100 μmol/L) significantly decreased RPF and VDD, MDP and APA (P<0.01), decreased V_max notably (P<0.05), prolonged APD₅₀ and APD₉₀markedly (P<0.01).(4) During perfusion with 10 μmol/L acetylcholine (ACh), VDD and RPF slowed down notably (P<0.05), APA decreased significantly (P<0.001), V_max slowed down notably (P<0.01),APD₅₀ shortened markedly (P<0.05), Atropine (10 μmol/L) antagonized the effects of ACh (10 μmol/L) on APD₅₀(P<0.05). These results suggest that there are probably α-adrenergic reecptor (α-AR), β-adrenergic receptor (β-AR) and muscarinic receptor (MR) on pacemaker cell membrane of left ventricular outflow tract in guinea pig. The spontaneous activities of left ventricular outflow tract cells are likely regulated by sympathetic and parasympathetic nerves.

Key words: neurotransmitters; guinea pig; ventricular outflow; electrophysiology

Received 2004-12-30 Accepted 2005-05-09

This work was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (No. 300379).

^*Corresponding author. Tel: +86-313-8041661; E-mail: ChenYJ010@yahoo.com

心室流出道一向被认为仅是心室向动脉输出血液的径路，因而对该部的电生理特性及功能一直未予以重视，也未见国内外有相关报道。心室流出道在发生上是由具有独立兴奋和收缩功能的动脉球演化而来，因而该部很可能仍保留有动脉球阶段的某些电生理特性，并在泵血功能中起一定作用。我室过去的工作发现，豚鼠、大鼠、家兔等左心室流出道(主动脉前庭)的特定部位存在慢反应自律细胞^[1]，对其电位特征、离子流基础及其与窦房结电生理特性的比较等进行实验分析，发现该电位特征以及0相和4相的离子流基础与窦房结起搏细胞相似^[2-4]。通过光镜和电镜观察该部位组织形态，发现左心室流出道存在慢反应自律细胞的部位富含神经纤维^[1] ，提示左心室流出道自律细胞的电活动可能受神经支配。本研究采用标准玻璃微电极细胞内记录技术，观察了肾上腺素能受体(adrenergic receptor, AR)和胆碱能受体激动剂及相应的受体拮抗剂对豚鼠左心室流出道部位自发慢反应电位的影响，以探讨自主神经对该部位的自律性是否也有调控作用。此外，目前临床上发现，一些过去无法解释和诊断的特发性室颤、早搏、心动过速等心律失常可能是由心室流出道形态异常和功能障碍所致^[5-7]，通过本研究也期望对源于心室流出道的这些特发性心律失常的发生机制，提供电生理学的实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物及试剂　　豚鼠，雌雄不拘，200~350 g，中国医学科学院实验动物研究所提供。异丙肾上腺素(isoprenaline, Iso)、肾上腺素(epinephrine, E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、阿托品(atropine) 均为天津金耀氨基酸有限公司产品，心得安(propranolol)为北京制药厂产品，酚妥拉明(phe-ntolamine)为上海旭东海普药业有限公司产品，上述药品均为市售针剂；ACh为上海试剂三厂产品(分析纯)。将上述药物按所需浓度分别溶于O₂饱和的改良Locke液(mmol/L：NaCl 157、KCl 5.6 、CaCl₂ 2.1、NaHCO₃ 1.8、葡萄糖5.6，pH 7.3~7.4)中，配制成不同的灌流药液以备使用。为保证药效，各种药液均在实验前1 h内配制。

1.2 标本制备　　豚鼠击昏后迅速开胸取出心脏，并用O₂饱和的改良Locke液经冠脉进行灌注冲洗后，从主动脉瓣的左瓣与后瓣间向下剪开心室，保留各瓣膜完整，并以此为宽度，向下切取约4 mm的前庭组织制成标本。制好的标本用不锈钢针固定于灌流槽( 1.5 cm×2 cm，容积约4 ml)内的硅橡胶上。用O₂饱和的改良Locke液进行恒温[( 35±1)℃]、恒速(10 ml/min)灌流，标本在灌流液中稳定30 min后开始实验。

1.3 电位引导　　玻璃微电极充以饱和KCl电极液后，直流电阻为 10~20 MW。将电极插入标本靠近右瓣与后瓣中间的下方部位，多数即可直接记录到自发慢反应电位；若记录不到，则将刺激电极置于标本远离瓣膜一端的心肌组织上，给予波宽 2 ms、1 Hz、两倍阈强度的方波刺激(SDQ-4 型三道电子刺激器，蚌埠实用技术研究所)，刺激时间由数秒至数分钟不等，直至诱发出稳定的自发节律，即停止电刺激开始实验。自发慢反应电位经 DWF-3型微电极放大器(军事医学科学院实验仪器厂生产)放大，一路输入监听器(JSD-731电生理仪，华南师院无线电厂)监听，另一路经高速数模转换器输入微机，自动显示电信号，并分析自发慢反应电位的各项参数指标。

1.4 观测指标　　最大舒张电位(maximal diastolic potential, MDP)、动作电位幅度(amplitude of action potential, APA)、0相最大去极速度(maximal rate of depolarization, V_max)、4相自动去极速度(velocity of diastolic depolarization, VDD)、复极50%和90%时间(50% and 90% of duration of action potential, APD₅₀and APD₉₀)以及自发放电频率(rate of pacemaker firing, RPF)。

1.5 实验过程和分组　　待自发节律稳定10 min后，开始采集一组正常的自发慢反应电位做对照，然后改用含有一定浓度并以O₂饱和的药液灌流，分别记录每次灌流后30 s、1、2、3、5、10 min时的电位变化。实验分组如下：肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂对左心室流出道自律细胞电活动的影响：(1)100 μmol/L Iso (n=7) ；(2)100 μmol/L Iso + 5 μmol/L心得安(n=7) ；(3)100 μmol/L E (n=7) ；(4)100 μmol/L NE (n=7) ；(5)100 μmol/L NE + 100 μmol/L酚妥拉明(n=7)。胆碱能受体激动剂和拮抗剂对左心室流出道自律细胞电活动的影响：( 1)10 μmol/L ACh (n=7) ；(2)10 μmol/L ACh +10 μmol/L阿托品(n=7)。

1.6 统计学处理　　数据以means±SEM表示，给药前后各项指标采用自身配对t检验，以P<0.05作为判断差异显著性的指标。

2 结果

2.1 肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂对左心室流出道自律细胞电活动的影响

2.1.1 Iso和心得安对左心室流出道自发慢反应电位的影响　　用100 μmol/L Iso灌流时，30 s时APA开始增大，3 min时达最大值，和正常对照组相比有显著差异(P<0.01) ；在5 min 时MDP绝对值增大(P<0.05)，V_max 加快(P<0.05)，APD₅₀明显缩短(P <0.01) ；VDD和RPF在灌流后30 s即开始增快，2 min时增至最高值，与正常对照组相比有显著差异(P <0.01)。上述各项指标的改变在10 min之内基本维持相对稳定(表1、图1A)。冲洗25 min后，上述指标基本恢复正常。

用100 μmol/L Iso灌流5 min，此时自发慢反应电位各项指标已有明显改变，然后改用100 μmol/L Iso + 5 μmol/L心得安灌流， 1 min时MDP绝对值、APA开始减小，2 min时V_max开始减慢(P<0.05)，5 min时MDP绝对值、APA明显减小，APD₅₀明显延长 (P<0.01)，V_max明显减慢，并维持相对稳定。VDD 和RPF在加入心得安灌流后1 min开始减慢，5 min时显著减慢(RPF, P<0.01; VDD, P<0.05)(表1、图1A)。冲洗20 min后，节律基本恢复。

2.1.2 E对左心室流出道自发慢反应电位的影响　　用100 μmol/L E灌流，APA明显增大(P<0.01)，
MDP绝对值有增大趋势，但无显著差异；V_max 明显加快(P<0.05) ；APD₅₀、APD₉₀明显缩短(P <0.05);VDD和RPF在灌流30 s时即开始增快，5 min时增快明显(RPF, P<0.01; VDD, P<0.01)，并维持在此水平(表1、图1B)。冲洗25 min后，上述指标基本恢复正常。

2.1.3 NE和酚妥拉明对左心室流出道自发慢反应电位的影响　　用100 μmol/L NE灌流时APA明显增大(P<0.05)，MDP绝对值有增大趋势，但无统计学意义；V_max在灌流1 min时开始加快，5 min时明显加快(P<0.05) ；APD₅₀明显缩短(P<0.05) ；VDD和RPF在灌流1 min时开始加快，5 min时达最快，并在10 min之内维持相对稳定，RPF由灌流前的(118.87±9.71) bmp变为(149.68±5.26) bmp，有显著性差异(P<0.05)(表1、图1C)。

用100 μmol/L NE灌流5 min，此时自发慢反应电位各项指标已有明显改变，然后改用100 μmol/L NE + 100 μmol/L酚妥拉明灌流5 min，5 min时MDP绝对值明显减小，APA明显下降(P<0.01) ；APD₅₀、APD₉₀明显延长(P <0.01) ；VDD和RPF在灌流30 s时开始减慢，5 min时RPF由灌流前的(149.68±5.26) bmp变为(90.75±6.97) bmp，VDD由(24.52±3.78) mV/s变为(9.70±1.97) mV/s，有显著性差异(P<0.01)(表1、图1C)。

另外，相同浓度的Iso、NE和E灌流组相比，Iso、E灌流组RPF增快更为明显( P<0.01)，而且节律变化较规整；而NE灌流组RPF虽有增快( P<0.05)，但不如Iso和E明显，而且在增快过程中偶尔出现节律不规整现象。VDD的改变在Iso灌流组更为明显(P<0.01)，而NE、E灌流组仅为P<0.05。

2.2 胆碱能受体激动剂和拮抗剂对左心室流出道自律细胞电活动的影响

用10 μmol/L ACh灌流1 min时， APA开始下降，5 min时APA明显下降(P<0.01)，V_max 明显减慢(P< 0.01)，APD₅₀明显缩短(P<0.05)，并随后维持在此水平；VDD和RPF在灌流1 min时即开始减慢，5 min时明显减慢(P<0.05)，有的出现停搏(表2、图2)。

用10 μmol/L ACh灌流5 min，此时自发慢反应电位各项指标已有明显改变，然后改用10 μmol/L ACh + 10 μmol/L阿托品灌流5 min，2 min时APD₅₀开始延长，5 min时改变显著(P<0.05) ；RPF有轻微增快，但无显著性差异。而且在阿托品灌流过程中，节律不规则，甚至会出现自发节律消失。采用不同浓度阿托品灌流时RPF的改变亦不明显(表2、图2)。

3 讨论

本室以前的工作证明，在豚鼠、家兔、大鼠等左心室流出道部位存在慢反应自律细胞，并通过光镜和电镜观察发现该部位富含神经纤维^[1]，提示其自律性可能受神经支配。

众所周知，心脏受心交感和心迷走神经双重支配。心交感神经末梢释放的NE及体液中的儿茶酚胺可作用于心脏自律细胞膜上的肾上腺素能受体，提高其自律性；心迷走神经末梢释放的ACh可作用于自律细胞膜的M型胆碱能受体(muscarinic receptor, MR)，使其自律性降低。本实验表明NE、E、Iso同样可使左心室流出道自发慢反应电位的发放频率增加；而ACh可使其自发节律降低，提示左心室流出道慢反应自律细胞的电活动可能同样受心交感神经和心迷走神经的调控。但NE、E和Iso及其受体拮抗剂的效应十分明显；而ACh的作用不够显著，而且其受体拮抗剂的效应较弱且不规则。据此可以推测左心室流出道慢反应自律细胞可能主要受心交感神经及体液中儿茶酚胺的调节，而心迷走神经的作用可能相对较弱。

心脏的AR包含有α₁-和β-两型。目前认为，儿茶酚胺主要与b₁-AR结合，进而通过加强4期内向电流(I_f)而起到正性变时作用。在本实验中用 NE、E和Iso三组灌流，均可引起左心室流出道自律细胞VDD加速和RPF增加。尤其是选择性 β-AR激动剂Iso对二者的作用尤为明显，而给予b-AR拮抗剂心得安后，由Iso引起的各项效应可被明显抑制。说明在豚鼠左心室流出道的自律细胞上同样存在β₁-AR。目前认为，心脏上的α₁-AR可分为α_1A、α_1B和α_1D三种亚型，在人类心脏中α₁-AR密度约为β-AR的一半^[8]。有研究表明，α_1A-、α_1B-受体亚型在左心房、右心房及乳头肌介导正性变力与变时效应，但与β-AR介导的效应有所区别^[9]。本实验的结果表明，使用非选择性α-AR拮抗剂酚妥拉明，也可抑制由NE引起的电位改变，说明在该种细胞上也有α₁-AR存在，NE也可通过与α₁-AR结合，引起细胞电位改变和正性变时作用。

另外，通过本实验对三组浓度相同(100 μmol/L)的Iso、E 和NE的作用相比较，可见三者对左心室流出道自律细胞的作用存在差异性，Iso的作用大于NE和 E，说明左心室流出道慢反应自律细胞膜上β₁-AR分布密度可能大于 α₁-AR。Iso灌流组节律较规整，而NE和E灌流组容易出现节律不齐，间接说明激动α-AR与激动β-AR的效应存在差异。

本室的前期研究表明，左心室流出道慢反应自律细胞的0相离子流基础与窦房结自律细胞相似，主要由I_Ca-L形成^[1,4]。儿茶酚胺能增加心肌细胞L型钙流(I_Ca-L)^[10]，故可使APA增大， V_max加速，APD₅₀缩短，本实验的结果与之相符。Iso、NE灌流组 MDP明显增大，E灌流组MDP绝对值也有增大趋势，可能是由于儿茶酚胺具有刺激生电性钠泵的作用之故^[11]。

副交感神经递质ACh对心脏具有直接抑制作用。ACh与心脏M₂受体结合后能减弱I_f内向离子流，使I_K进行性衰减减慢^[11] ，从而使VDD和RPF减慢；ACh可使Ca²⁺内流减少，从而导致APA降低和V_max减慢^[12]; 即通过G蛋白介导直接激活心脏K(I_K-ACh )通道，使复极期K⁺外流加速^[13] ，APD₅₀显著缩短。在本实验中ACh可引起与上述基本相同的反应。另有资料表明，在离体状态下阿托品可拮抗等摩尔浓度的ACh对离体豚鼠心室肌AP的直接作用，使APD延长^[14]。本实验中使用阿托品后，APD₅₀也有明显恢复，与上述文献报道一致，说明左心室流出道慢反应自律细胞膜上同样可能存在MR，但VDD和RPF的恢复无显著性，这一现象尚待今后进一步研究和探讨。

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