Acta Physiologica Sinica, October 25, 2005, 57(5): 643-647

研究论文

血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞表达上调基因的分离和鉴定

王新凤¹，高广道1,*，杨予白 ¹，周 娟¹，王亚文¹，苏兴利² ，王 琰³, 韩锋产³，白玉杰³

¹西安交通大学医学院病理生理教研室，西安710061 ；²陕西医学高等专科学校病理生理教研室，西安 710068；³第四军医大学基因诊断研究所，西安 710032

摘 要：为了对成年大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CF)受血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析，以受AngⅡ刺激CF为实验方，未刺激CF为驱动方，进行抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)，建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将表达变化显著的部分阳性克隆测序及同源性分析，共获得19个上调表达的基因，分别与细胞外基质、细胞周期、胞内信号转导、细胞骨架及细胞代谢等功能相关，并克隆到7个新的基因表达序列标签(expressed sequence tags, EST)。我们的数据证实了SSH可以有效地克隆成年大鼠CF受 AngⅡ刺激后上调表达基因，对这些基因的研究将有助于阐明心肌重塑的分子机制。

关键词：重塑；血管紧张素Ⅱ；成纤维细胞；抑制消减杂交

中图分类号：R363.2⁺1

Identification of up-regulated genes induced by angiotensin II in cardiac fibroblasts

WANG Xin-Feng¹, GAO Guang-Dao^1,*, YANG Yu-Bai¹, ZHOU Juan¹, WANG Ya-Wen¹, SU Xing-Li ², WANG Yan³, HAN Feng-Chan³, BAI Yu-Jie³

¹Department of Pathophysiology, Medical College of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China; ²Department of Pathophysiology, Shaanxi Medical College, Xi'an 710068, China; ³Institute of Genetic Diagnosis, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China

Abstract: To identify up-regulated genes in adult rat cardiac fibroblasts (CF) induced by angiotensin II (Ang II), suppression subtractive hybridization (SSH) was performed between the CF stimulated by Ang II (tester) and unstimulated CF (driver) to generate subtractive cDNA library. The library was screened with dot blots hybridization to further verify the differentially expressed cDNA clones. Partial positive clones (19 up-regulated genes) were sequenced and BLAST analyzed. Twelve up-regulated genes related to extracellular matrix, cell cycle, intracellular signal transduction, cell cytoskeleton, cell metabolism and 7 new expressed sequence tags (EST) were acquired (GenBank accession number: CN382808, CN382809, CN382810, CN382811, CN382812, CN382813, CN382814). Our data reveal that SSH is a powerful technique of high sensitivity for the detection and cloning of up-regulated genes expressed in CF induced by AngII, which may be helpful to clarify the mechanism of cardiac remodeling.

Key words: remodeling；angiotensin II；fibroblasts；suppression subtractive hybridization

Received 2005-01-20 Accepted 2005-03-25
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30271435).
^*Corresponding author. Tel: +86-29-82655164; E-mail: gaogd@mail.xjtu.edu.cn

心肌重塑(cardiac remodeling)是心脏对负荷增加的一种适应代偿性反应，其主要病理变化包括细胞的反应性变化及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增生，由此导致心肌肥厚、心肌纤维化、心腔容积扩大，进行性发展导致心肌舒缩功能降低，终将衰竭。在心肌重塑的发展过程中，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统最重要的效应分子，可诱导心肌间质的主要构成细胞，即心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CF)经历增殖、分化、合成ECM增多等一系列变化。研究发现CF在AngⅡ刺激下，能合成分泌多种细胞活性物质，如转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-bβ)、内皮素-1 (endothelin-1, ET-1)、血小板源生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)等，这些活性物质再以旁分泌、自分泌或细胞内分泌方式调控CF自身和CF周围心肌细胞的代谢、结构和功能^[1-3]。AngⅡ还可诱导 CF向肌成纤维细胞分化，表达a-SMA(a-smooth muscle actin)增多，合成分泌大量胶原、纤维连接素(fibronectin )、层粘蛋白(laminin)等ECM成分^[4,5]。AngⅡ对 CF的上述效应是通过CF胞内不同的信号途径介导，且不同的信号通路之间存在相互交流 (cross-talk)，目前对AngⅡ受体激动后胞内信号转导通路的分子机制尚未完全阐明。本研究在我室有关AngⅡ与心肌重塑研究的工作基础上，采用抑制消减杂交技术( suppression subtractive hybridization, SSH)分离鉴定AngⅡ诱导CF表达上调基因，进一步探讨AngⅡ促心肌重塑发生发展的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料　　实验动物: 雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250~300 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。DMEM和TRIzol试剂(Gibco公司); 胶原酶、胰蛋白酶和AngⅡ(Sigma公司); 胎牛血清和[α-³²P]-dATP (华美生物工程公司); Oligotex mRNA Spin-Column kit (Qiagen公司); PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit 和 Advantage polymerase mix (Clontech公司); pGEM T-Easy vector (Promega公司); 其它试剂均为进口或国产分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养　　采用本室已建立的方法^[6]分离培 养原代成年大鼠心肌成纤维细胞。DMEM中含20%胎牛血清，在37℃，5%的CO₂培养箱中培养至亚融合状态时，将培养液换成含AngⅡ(1 μmol/L)的无血清DMEM处理48 h。对照组除不加AngⅡ外，其余处理同AngⅡ干预组。

1.2.2 总RNA提取和mRNA分离　　用TRIzol试剂提取两组总RNA，甲醛凝胶变性电泳检测RNA完整性；用Oligotex mRNA Spin-Column 试剂盒分离mRNA。

1.2.3 抑制消减杂交　　按PCR-SelectTM cDNA Subtraction试剂盒说明操作，以AngⅡ干预组cDNA作为实验方( tester)，对照组cDNA作为驱动方(driver)进行正向抑制消减杂交。基本实验步骤如下：(1)将实验方和驱动方两组的mRNA反转录合成 cDNA，经RsaⅠ酶切成平头末端片段；(2)把实验方cDNA均分为两份，分别与接头1和2R连接，进 行连接效率分析；再分别与变性的过量驱动方cDNA杂交；(3)杂交后，将两份样本混合再继续与 变性的驱动方cDNA杂交；(4)经巢式PCR扩增消减杂交的cDNA；(5)同理，以AngⅡ干预组cDNA作 为驱动方、对照组cDNA作为实验方进行反向抑制消减杂交。

1.2.4 消减cDNA文库的构建　　将正向消减杂交产物第二轮PCR扩增后连接到pGEM T-Easy vector，转化感受态大肠杆菌DH-5a，通过蓝白斑筛选有插 入片段的克隆。

1.2.5 斑点杂交　　PCR扩增阳性克隆的插入片段，浓缩后点样于尼龙膜上。取正向和反向消减杂交第 二轮PCR产物，用[α-³²P]-dATP按随机引物法标记 为探针，68℃杂交过夜，在严谨条件下洗膜后放射自显影过夜。

1.2.6 阳性克隆测序及同源性分析　　挑选斑点杂交筛选的部分阳性克隆进行测序(ABI 3700测序仪);测序结果进行GenBank数据库的同源性分析。

2 结果

2.1 cDNA接头连接效率分析

AngⅡ干预组和对照组细胞的总RNA OD_260/280测定值在1.8~2.0之间，甲醛变性凝胶电泳检测 RNA质量良好(28S rRNA和18S rRNA亮度比在1.5~1.9之间)。分别提取两组mRNA并反转录合成 cDNA，用RsaⅠ酶将两组cDNA切成平头末端片段。将实验方酶切后产物加上特异性接头片段，接 头连接效率分析表明实验方有25%以上连上了接头(图1)。

2.2 SSH结果

实验方连上接头后，经过消减杂交及巢式PCR，将消减cDNA第二次PCR产物经2%琼脂糖 凝胶电泳分析，从图2中可见已消减的cDNA集中在0.5~0.7 kb之间，与未消减cDNA条带分布不同，表明实验方和驱动方中相同表达的基因已被消减。

2.3 斑点杂交

随机挑选消减cDNA文库中96个白色菌落进行斑点杂交进一步筛选阳性菌落，仅选取与正向消减探针杂交或杂交信号明显强于反向消减探针的克隆，部分杂交结果见图3。

2.4 DNA测序与同源性分析

将斑点杂交筛选的部分阳性克隆(20个)测序后经BLAST同源性比较，显示有2个序列相同，共获得 19个上调表达基因，其中包括12个不同的已知基因和7个新的基因表达序列标签(expressed sequence tags, EST)。已知基因包括ECM基因、细胞增殖相关分子、细胞骨架蛋白和细胞代谢相关分子(表1)。

3 讨论

SSH是由Diatchenko等^[7,8]建立的用于筛选差异 表达基因的新技术,其原理是在抑制PCR基础上的消减杂交。抑制PCR利用链内退火优于链间退火的特 点，使非目的序列片段两端的反向重复序列在退火时产生锅-柄样(pan-handle like)互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性的抑制非目的基因片 段的扩增。消减杂交去除了实验方与驱动方间的同源序列。SSH具有快速、灵敏、高效的特点，有 利于检出某些低丰度表达的mRNA。我们利用此方法获得了19个AngⅡ诱导CF表达上调基因，主要包括: ECM基因(fibronectin、pro α 1 collagen type Ⅲ)、细胞增殖相关分子(IGFBP3、MBP1、grp75、P68及cdc2)、细胞骨架蛋白( vimentin)和细胞代谢相关分子(ferritin-H、succinyl-CoA synthetase、snapin)。同时也获得17个AngⅡ诱导CF表达下调基因，其中有4个为新基因(GenBank No.: CN382804、CN382805、CN382806、CN382807)^[9] 。

心肌ECM蛋白不仅仅是发挥对组织细胞的支持、连接等物理作用的机械支架，它还参与细胞间的信息传递和许多生物过程的调节，如细胞的代谢、生长、迁移、分化等行为。本实验检测到的 纤维连接素表达上调与Iwami等在大鼠CF上得到的结果一致^[10]。研究发现，AngⅡ可通过钙依赖的酪氨酸激酶途径激活表皮生长因子受体的下游信号通路 从而诱导纤维连接素的表达，而且有两个调控机制参与了AngⅡ诱导纤维连接素mRNA的表达: 一个是由c-Fos/c-Jun复合物结合在AP-1位点上介导的转录水平调节；另一个是通过调控mRNA稳定性进行的转录后调控，且后者与TGF-β的自分泌及旁分泌效应有关^[11,12]。

在AngⅡ刺激下，CF膜受体激活，胞内信号转导通路发生相应的变化。本研究发现的IGFBP3，其功能除了转运IGF外，还具有抑制细胞增殖的作用。它的抗增殖信号途径涉及到 β-importin依赖的转运机制及TGF-β信号通路的活化^[13] 。IGFBP3通过影响Bax和Bcl-2的蛋白表达参与对细胞凋亡的调节^[14]。MBP1是Gallagher等^[15]用酵母双杂交技术筛选的突变型p53结合蛋白，它是原癌基因的产物。成年个体MBP1 mRNA的表达有组织特异性。组织异位过表达MBP1将会促进肿瘤形成及瘤细胞的生长。Grp75属于热休克蛋白70家族，存在于多个细胞器中。研究发现，过表达 Grp75可延长细胞的生存周期^[16]。P68属于DEAD 核蛋白家族，具有RNA解旋酶和ATP酶活性。在C₃H小鼠NC₃H₁₀成纤维细胞中进行的P68过表达实 验证明P68可改变细胞固有的生长进程，明显增强细胞的生长与分裂速度^[17]。上述研究虽不是以大鼠CF为实验对象，但结果提示本研究检测到的AngⅡ诱导CF表达上调基因如MBP1、Grp75和P68等与AngⅡ促CF增殖效应关系密切，其具体相互作用机制需要实验来进一步揭示。

此外，AngⅡ还会影响到CF的细胞周期、细胞代谢等过程。而且从我们建立的AngⅡ诱导CF 表达上调基因文库中筛选出几个功能尚未阐明的新基因，它们在心肌重塑中的作用尚不清楚，有待于深入研究。我们报道的这些上调基因仅是AngⅡ诱导CF基因表达谱的一部分，对于其功能及调控 机制还需要进一步探索。

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