生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2006, 58 (6): 529-535
研究论文
椎管内注射牛肾上腺髓质22肽差异性翻转吗啡耐受作用
江剑平，陈雅娟，洪炎国*
福建师范大学生命科学学院人体解剖生理教研室，福建省发育和神经生物学重点实验室，福州 350007
摘 要：牛肾上腺髓质22肽(bovine adrenal medulla 22, BAM22)是脑啡肽原A的一种降解产物，与阿片受体和感觉神经元特 异性受体(sensory neuron-specific receptor, SNSR)均有亲合力。本研究的目的是探讨BAM22对吗啡耐受的影响。连续7 d对大鼠椎管内注射20 μg吗啡形成吗啡耐受后，分为吗啡组、盐水组和BAM22组，第8天三组大鼠椎管内分别注射吗啡、 生理盐水和BAM22，第9天三组大鼠椎管内均注射吗啡后，运用撤足反射、福尔马林实验和免疫组织化学等 方法观察吗啡的作用效果。结果显示：在撤足反射实验中，BAM22组的吗啡能延长撤足反射潜伏期最大可能作用的48.5%，并持续约1 h；在福尔马林实验中，BAM22组的吗啡能分别缩短福尔马林引起的第一期和第二期疼痛行为变化3.2 min和24 min，比盐水组分别减少45%和82% (P<0.05, P<0.001); 此外，在免疫组织化学实验中，BAM22组的吗啡能显著减少热刺激引 起的脊髓背角c-Fos蛋白表达，其I-II层、III-IV层和V-VI层均减少约80% (P<0.001)。本研究从整体和细胞水平表明，BAM22能翻转吗啡的耐受，这种作用在持续性疼痛模型中的表现要比急性痛中更为明显，显示BAM22对吗啡耐受的差异 性调制；同时也提示感觉神经元特异性受体可能参与吗啡耐受的调制。
关键词：牛肾上腺髓质22肽；吗啡耐受；伤害性感受；脊髓背角；c-Fos蛋白
中图分类号：Q426
Differential reversal effect of intrathecal bovine adrenal medulla peptide 22 on morphine tolerance in rats
JIANG Jian-Ping, CHEN Ya-Juan, HONG Yan-Guo*
Department of Anatomy and Physiology, College of Life Sciences, Fujian Normal University, Key Laboratory of Developmental and Neurological Biology of Fujian Province, Fuzhou 350007, China
Abstract: Bovine adrenal medulla 22 (BAM22), an endogenous opioid peptide, is one of the cleavage products of proenkephalin A. It potently activates opioid receptors and sensory neuron-specific receptor (SNSR). The present study was aimed at investigating the effect of BAM22 on morphine tolerance. Intrathecal (i.t.) administration of morphine for 7 d produced morphine tolerance in rats. Then the rats were divided into three groups in which morphine, saline or BAM22 were administered i.t., respectively, on day 8, and morphine was given to all of the animals on day 9. It was found that morphine administered on day 9 resumed antinociceptive effects in BAM22 group, but not in saline or morphine group. The potency of morphine in BAM22 group was 48.5% of the maximal possible effect (MPE) detected by paw withdrawal test and the antinociception persisted for approximately 1 h. Following the similar treatment, morphine administered on day 9 reduced nocifensive behaviors by 3.2 min and 24 min in BAM22 group in the first and second phases, in the formalin test, respectively. The decreases were 45% and 82% of the corresponding values observed in saline group. Furthermore, following the treatment with BAM22 (10 nmol) on day 8 in morphine-tolerance rats, morphine administered on day 9 decreased the expressions of the heat-evoked c-Fos-like immunoreactivity (FLI) protein by approximately 80% in laminae I-II, III-IV and V-VI in the spinal cord at L4-L5 compared with that in saline or morphine group. The present study provided evidence at behavioral and cellular levels showing that BAM22 resumed antinociception of morphine. The results that the reversal effect of BAM22 on morphine tolerance was more efficient in persistent pain model than in acute pain may indicate that BAM22 differentially modulates morphine tolerance. The present study suggests that SNSR is involved in the modulation of morphine tolerance.
Key words: bovine adrenal medulla 22; morphine tolerance; nociception; spinal dorsal horn; c-Fos protein
吗啡等阿片类药是临床上用得最多的镇痛药物之一，它们主要是通过作用于中枢神经系统的阿片 受体而发挥镇痛效应。但这类药物有不少副作用，长期使用会产生药物耐受，大大限制了其临床应 用。因此，寻找能够翻转或延缓吗啡等阿片类药物镇痛作用的药物甚为重要。
牛肾上腺髓质22肽(bovine adrenal medulla peptide 22, BAM22)是一种内源性阿片肽，是脑啡肽原(proenkephalin A，内源性Met-和Leu-enkephalins的前体) 自然降解的一种产物，含有22个氨基酸[1]。这个多肽发现于上世纪80年代，广泛分布于大脑、 丘脑、脑干和脊髓[2-4]，但生理功能却一直不清楚。在结构上，BAM22神经肽具有阿片的典型氨基酸序列(Tyr-Gly-Gly-Phe-)，与μ-[5,6]、δ-[7] 和κ-[8-10]三类阿片受体亚型都有很高的亲和性，且其结合可被广谱阿片受体拮抗剂纳洛酮所阻断[9]。最近发现一类 受体，只独特分布在背根神经节中管理痛觉的小型神经元中，称感觉神经元特异性受体(sensory neuron-specific receptor, SNSR)[7]，而BAM22是动物体内至今所知唯一自然存在的、能与SNSR结合的配体[7]，因而重新引起人们对BAM22的兴趣。
我们实验室已证实，椎管内注射BAM22能抑制大鼠疼痛的产生 [11]，抑制伤害性刺激引起的脊髓背角神经元的活动 [12]; BAM22还能翻转吗啡的耐受性[13]。本文应用急性和持续性疼痛模型，从整体和 细胞水平进一步研究BAM22对吗啡耐受的调制作用，以期探讨SNSR与阿片受体之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 成年雄性Sprague-Dawley 大鼠，体重220~300 g，由福建医科大学实验动物中心提供。动物饲养在昼夜周期各为12 h (白昼时间为7:00~19:00)的恒温、恒湿度的十万级洁净动物室 内，供给充足的食物和水。动物实验符合国家《实验动物管理条例》，并经福建师范大学实验动物伦 理委员会认可。
1.2 试剂 BAM22为瑞士Bachem公司产品；Vectastain ABC kit为美国Vector Laboratories公司产品，编号PK-4001；浓缩型DAB试剂盒为北京中 山生物技术有限公司产品，编号ZLI-9032；福尔马林为美国 Amresco公司产品；吗啡为沈阳第一制药厂产品；其余试剂均为分析纯。
1.3 仪器 Microm (美康) HM550型冷冻切片机为德国制造；Olympus BX51型显微镜和Olympus DP70型数码照像机均为日本制造；DK-S22型电热恒温水浴锅为上海精宏实验设备有限公司产品； PE-10插管为美国 Stoelting公司产品；微量进液器为Switzerland Hamilton Bonaduz AG 产品； Mettler Toledo (梅特勒-托利多) AL104型电子天平为中国上海产品；大鼠固定装置为成都泰盟仪器厂 产品。
1.4 方法
1.4.1 椎管内插管与椎管内注射 椎管内插管按Yaksh方法进行 [14]: 以50 mg/kg戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉后，局部消毒，切开皮肤，分离肌肉， 暴露枕骨大孔，轻轻挑破寰枕膜，用事先注入生理盐水、长 14 cm的PE-10插管向尾侧缓缓插入脊髓蛛网膜下腔，进管约7.0~8.0 cm，见有脑脊液流出后即封住外口。缝合创口处的肌肉和皮肤，并将 PE-10管固定于浅层肌肉上，以防脱落。术后观察大鼠的运动情况，选择活动正常 (前后肢无瘫痪)、术后体重下降不超过20%、利多卡因实验阳性的动 物进行实验。椎管内注射2%利多卡因10 μl，并以10 μl生理盐水缓慢冲洗，2 min内后肢出现瘫痪的动物，即视为利多卡因实验阳性。手术后，每 只大鼠单独饲养在一个笼子中，让其恢复至少5 d。实验时，动物在清醒状态下，放置于特制的固定装置内，并限制其活动， PE-10细管暴露在装置外。通过PE-10细管用微量进液器椎管内注射相关药 品。药物容量为10 μl，药品注射完毕后都需再注入10 μl生理盐水缓慢冲洗，确保药品全部进入大鼠椎管内。
1.4.2 吗啡耐受模型的复制及动物分组 参照Powell等人报道的方法 [15]，每天同一时间以20 μg吗啡对大鼠进行椎管内注射，连续7 d，即制得吗啡镇痛耐受模型。吗啡耐受大鼠随机分为以下三组：吗啡组，第8和第9天均注射20μg吗啡；盐水组，第8天注射10 μl生理盐水，第9天注射20 μg吗啡；BAM22组，第8天注射10 nmol BAM22，第9天注射20 μg吗啡。
1.4.3 行为学观察
1.4.3.1 撤足反射潜伏期(paw withdrawal latency, PWL)测定 实验前将大鼠放于特定固定装置内，脚可以自由活动。将大鼠后肢踝关节以下间断浸入 30℃的温水中，连续训练3~5d，使其适应操作。以PWL作为疼痛指标 [13,16,17]。把大鼠放于特制固定装置内，待其安静后，将大鼠后肢踝关节以下水平 浸入47℃热水，测定PWL。给药前间隔3 min测量1次，取2次测定的平均值作为基础潜伏期。给药后，每隔 10 min测量一次PWL。为防止组织损伤，刺激时间以20 s为限。结果以最大可能作用的百分数 (% maximal possible effect, %MPE)＝100%譡(给药后反射潜伏时间-基础反射时间)/(20- 基础反射时间)]表示。
1.4.3.2 福尔马林测试 福尔马林实验在有机玻璃观察箱(30 cm×30 cm×30 cm)中进行。实验前将大鼠置于观察箱内，连续训练3~5 d，每天约1 h，使其适应环境。椎管内注射药物或生理盐水10 min后，在一侧后足脚掌皮下注射2.5%福尔马林50 μl，立即置于观察箱内，观察并记录大鼠的缩腿、舔爪等行为变化。缩腿表现为注射足抬起而不着台面，完 全不支持体重；舔爪表现为用嘴舔、咬注射足。本实验采用 Hong等[11]所推荐的以缩腿加上舔爪等护痛行为作为伤害性反应，记录其持续的时间。每 5 min为一个周期，共计1 h。运用自编软件记录大鼠的缩腿舔爪的累积时间。0~10 min为第一期，之后10~15 min为间歇期，15~60 min为第二期。
1.4.4 免疫组织化学实验 各组大鼠椎管内注射20 μg吗啡后，把后肢踝关节以下浸入47℃的热水中，每10min 一次，每次10 s (若PWL小于10s，则累加计算)，共6次。1 h后，腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行深度麻醉，取脊髓腰膨大段。取材和c-Fos免疫细胞化学反应参照 Zeng等[12]和Nie等[18]报道的方法进行。每只大鼠随机取切片 10张，按照Molander等[19]对脊髓灰质的分层，采用双盲法分 别统计脊髓背角灰质浅层 (I-II层)、固有核 (III-IV层) 和颈部 (V-VI层) c-Fos染色阳性(c-Fos-like immunoreactivity, FLI)细胞的数量。
1.5 统计学方法 各组数据均以means盨EM表示，多组数据间以 Sigmastat软件采用单因素方差分析(one way ANOVA)并继之以Tukey抯检验进行统计分析，以P<0.05 表示差异有显著性。
2 结果
2.1 吗啡耐受大鼠中BAM22对吗啡在PWL中作用的影响
连续每天一次椎管内注射吗啡(20 μg)会导致吗啡的抗伤害作用逐渐减弱。第1天，椎管内注射吗啡使PWL延长为94.9% MPE。在连续椎管内注射吗啡的第7天，吗啡使PWL仅延长6.7% MPE，与第1天吗啡的作用相比有显著性差异(n=8, P<0.001)，表明大鼠对吗啡的镇痛作用产生了耐受(图1A)。
在吗啡耐受大鼠中，第8天椎管内注射20 μg吗啡(吗啡组，n=8)后，第9天椎管内注射吗啡所 引起的PWL仅增加5.7% MPE，与第7天相比，没有统计学差异(P>0.05); 第8天椎管内注射生理盐水(盐水组，n=7)后，第9天椎管内注射吗啡所引起 的PWL也仅增加2.2% MPE，与第7天相比，也没有统计学差异(P>0.05)。可是，当第8天椎管内 给予10 nmol BAM22后(BAM22组，n=8)，第9天椎管内注射吗啡使PWL明显延长，由第7天的4. 8% MPE上升到第9天的48.5% MPE (P<0.001)，与吗啡组和盐水组第9天吗啡的作用相比也存在显著 性差异(P<0.001)。
图1B进一步显示BAM22作用后吗啡引起PWL的变化和持续时间。在BAM22组，椎管内注射吗啡的第1天，吗啡延长PWL的能力强而持久，在1 h的测试时间内，其作用均维持在90% MPE以上。但在持续用药的第7天，吗啡只能使PWL少量增加 (9% MPE以内)。经过第8天BAM22的处理，第9天吗啡延长PWL的能力最多可达48.5% MPE，并持续约60 min，与第7天吗啡耐受时的作用相比，有统计学差异(P <0.05, P<0.01, P<0.001); 但也明显低于第1天吗啡的作用(P<0.001)。
2.2 吗啡耐受大鼠中BAM22对吗啡在福尔马林致痛中作用的影响
从图2可见，大鼠在接受椎管内生理盐水加足底注射福尔马林(非耐受盐水组, n=7)后，其注射足缩腿、舔爪反应呈现两期，第一期开始于注射之后，持续约10 min，接着是约5 min的间歇期，之后约45 min为第二期。这种行为变化时程与前人的报道相类似 [11,20]。
在吗啡组(n=7)或盐水组(n=4)中，第8天椎管内注射吗啡或生理盐水，第9天椎管内注射吗啡后，福尔马林足底注射仍引起明显的第一期和第 二期的缩腿、舔爪行为，其持续时间分别达到6.3 min、30.5 min和7 min、29.3 min，两组间没有显著性差异。与非耐受盐水组相比也没有显著性 差异(P>0.05)。然而，在BAM22 (n=8)组，吗啡耐受大鼠椎管内注射BAM22后的第2天，椎管内 给予吗啡能明显抑制福尔马林足底注射所引起的缩腿、舔爪 行为。在第一期，缩腿、舔爪时间累计为3.8 min，明显短于吗啡组或盐水组(P<0.05)，其时程分别缩短了39.6%和45.7%；在第二期，吗啡的抑制作用更为明显，福尔马林所引起的缩腿、舔爪时间累计仅为5.3 min，大大短于吗啡组或盐水组(P<0.001)，其时程分别缩短了82.6%和81.9%。
2.3 吗啡耐受大鼠中BAM22对吗啡在热刺激引起的c-Fos蛋白表达作用中的影响
伤害性热刺激大鼠后足引起的腰段脊髓背角c-Fos蛋白表达变化见图3和图4。热刺激大鼠后足主要引起同侧腰段脊髓背角c-Fos 蛋白表达(图3A、B)。吗啡耐受后，在盐水组(n=6, 图3A、B，图4)，伤害性热刺激引起同侧脊髓背角浅层(I-II层) c-Fos阳性细胞数量为23±2，而在固有核(III-IV层)和颈部 (V-VI层)，c-Fos阳性细胞分别为14±2和18±3。在吗啡组(n=6,图3C、图4)，脊髓背角I-II层、III-IV层和V-VI层c-Fos阳性细胞数量分别为27±7、13±1和20±2，与盐水组没有显著性差异(P>0.05)。在BAM22组(n=7, 图3D、图4)，脊髓背角I-II层、III-IV层和V-VI层的 c-Fos阳性细胞数量分别为5±1、3±1和3±1，与盐水组相应各层 c-Fos阳性细胞数量相比，分别减少了78.3%、78.6%和83.3% ；与吗啡组相比，分别减少了81.5%、76.9%和85.0%，均存在显著性差异(P<0.001)。
3 讨论
我们观察到连续椎管内注射吗啡，吗啡抑制急性伤害性热刺激感受的作用明显降低；而注射同样 属于阿片肽的BAM22后，吗啡的抗伤害作用得到明显恢复。这个结果不太可能是由BAM22直接作用所 致，因为BAM22作用持续时间很短，一般在1 h左右[11,13]。在BAM22组，吗啡的镇痛作用恢复不可能是因为第8天中断了吗啡的应用，因为在盐水组，第8天同样也中断了吗啡的应用，但是第9天 吗啡仍无抗伤害性作用。本研究表明BAM22能恢复吗啡的抗伤害性作用，证实了我们过去的实验结果 [13]。进而，我们对吗啡的作用时程进行了比较，发现 BAM22应用之后，吗啡的抗伤害作用在作用效力和作用时间上，都大大高于对照组；但明显低于(不 及)吗啡对正常动物的作用。
为了进一步观察BAM22对吗啡耐受的调制作用，我们又采用了福尔马林痛模型，因为福尔马林 引起的持续性痛和温度刺激引起的急性痛的机制是不同的。它是化学刺激引起的炎性过程，表现为即 刻剧烈疼痛的第一期(5~10 min)，间以5 min的无痛期，然后再是长达45 min以上持续痛的第二期。第一期是外周传入纤维受刺激所致，而第二期被认为是由NMDA介导的中枢敏感化[21,22]和外周受到刺 激产生的持续输入[23]综合的结果。我们的结果显示，连续应用吗啡7d后，吗啡对福尔马林疼痛反应完全失去抑制作用，但第8天给予 BAM22后，吗啡又能够重新显著抑制福尔马林引起的疼痛反应， 尤其是对于第二期。这个结果也不可能是因为第8天中断使用吗啡而导致其作用的恢复，因为第8天 给予生理盐水并不能改变吗啡的耐受。在吗啡耐受大鼠中，给予 BAM22后的第2天，在吗啡的作用下，福尔马林引起的第二期痛反应缩短了约24 min，只有5.3min左右，这和我们在非吗啡耐受大鼠中所观察到的吗啡使福尔马林只能产生(3.95±2.33) min的痛行为[11] 十分接近。表明吗啡对福尔马林痛反应的抑制效力已完全恢复。这是一个有趣 的现象，和BAM22只能部分翻转吗啡对热刺激引起的急性痛感受不一致，提示 BAM22能在吗啡耐受后差异性地调制吗啡对炎症引起的持续性疼痛的作 用。由于福尔马林痛第二期的产生与NMDA受体介导有关 [21,22]，这一结果可能提示BAM22对其有调制作用。我们实验室对这一可能机制的研究正在进行 之中。
脊髓背角c-Fos蛋白表达已被广泛接受作为伤害性信息激发神经元的间接生物学标志[24,25]。本文中，对吗啡耐受大鼠给予吗啡，伤害性热刺激仍引 起c-Fos大量表达于同侧脊髓背角第I-II层，和文献报道类似[11,26]。不过，c-Fos在第III-IV 和V-VI层也有明显的表达，这可能和我们用的标本处理有关，因我们用的是吗啡耐受大鼠。c-Fos在第III-VI层有明显的表达也见于吗啡耐受加福尔马林足底 注射的大鼠[27]。我们观察到，对吗啡耐受大鼠给予 BAM22之后，再给予吗啡，则伤害性热刺激引起的c-Fos在脊髓背角第 I至VI层中的表达都明显减少，和我们在正常大鼠(无吗啡耐受)中所见吗啡对伤害性 热刺激引起的c-Fos的抑制作用几乎相当[12]。这就 从细胞水平表明吗啡的抗伤害作用得到恢复。
目前尚未弄清楚阿片耐受的分子机制，但阿片受体的作用 (受体下调等)已被公认是其中重要的一个起始环节[28]。如前所说，BAM22可同时作用于阿片受体和SNSR，吗啡耐受产生后，阿片受体失去 敏感性(desensitization)，BAM22就无法通过阿片受体而起作用。那么，BAM22就只能通过SNSR而发挥其作用了。因此，我们推测BAM22 部分恢复吗啡的抗伤害作用很可能是通过SNSR翻转阿片受体敏感性的结果。这一推测还有待于应用 SNSR特异性激动剂进一步证实。
本文从细胞水平证实了BAM22恢复阿片受体的敏感性，这个研究也提示 SNSR可能具有调制阿片受体的功能。此外，本实验进一步提供了在吗啡产生耐受后，BAM22可能替代吗啡作为镇痛药物的依据，并且进而表明了 BAM22恢复吗啡抑制炎性持续性疼痛的特殊效用。
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