研究论文
在低氧预处理延迟心肌保护中钙网蛋白表达升高
徐菲菲，付 艳，刘凤英，祝筱梅，刘秀华*
中国人民解放军总医院病理生理研究室，北京100853
摘 要：本文分别在整体实验和细胞培养条件下研究钙网蛋白(calreticulin, CRT)在低氧预处理(hypoxic preconditioning, HPC)延迟心肌保护中的表达及其信号转导机制。(1)整体实验时Wistar大鼠随机分为3组：假手术(sham)组、仅结扎冠状动脉的 心肌缺血(myocardial infarction, MI)组和HPC后再结扎冠状动脉的HPC+MI组，分别于术后24 h、14 d和28 d观察HPC对缺血后心功能和梗死区、危险区面积的影响；采用Western blot检测CRT表达以及p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)活性。(2)原代培养Sprague-Dawley乳鼠心肌细胞，随机分为6组：低氧/复氧 (hypoxia/reoxygenation, H/R)组、HPC组、HPC+H/R组、p38 MAPK抑制剂SB203580+HPC+H/R (SB+HPC+H/R)组、SAPK抑制剂SP600125+HPC+H/R (SP+HPC+H/R)组和正常对照组；采用台盼蓝排斥实验、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性检测及流式细胞仪检测各组细胞损伤情况；采用Western blot检测CRT表达及p38 MAPK、SAPK的磷酸化水平。主要结果如下：(1)整体动物实验结果表明，HPC改善缺血对心 肌左室压力最大上升/下降速度(±dp/dt max)的抑制，限制心肌梗死面积；HPC后CRT表达呈动态变化：术后24 h时HPC+MI组CRT表达增高106% (P<0.05 vs MI组)，以危险区最为显著；14 d至28 d表达逐步降低。相关分析显示，术后24 h时CRT表达量与心功能呈正相关(r=0.9867, P<0.05)，与梗死面积呈负相关(r=-0.9709, P<0.05)。 (2)细胞培养实验结果表明，HPC可减轻H/R诱导的心肌细胞LDH漏出，增加心肌细胞存活率，降低细胞凋亡；单纯HPC可诱导CRT表达轻度增加 (222%，P<0.05 vs对照组)，而损伤性H/R诱导CRT过表达(503%， P<0.05 vs对照组)，HPC可降低H/R诱导CRT表达升高的幅度；p38 MAPK活性与HPC诱导的CRT表达呈正相关(r=0.9021, P<0.05)，而SAPK活性与其呈负相关(r=-0.8211, P<0.05)。由此得出结论：(1)整体实验中HPC可明显改善缺血后心脏的收缩与舒张功能，限制心肌梗死范围，促进危险 区心肌恢复；心肌梗死早期，HPC诱导CRT表达上调，参与心肌保护；(2)细胞培养实验中HPC可诱导CRT适度表达， 增强原代培养乳鼠心肌细胞对H/R损伤的抵抗力；p38 MAPK可能介导HPC诱导的CRT表达，而SAPK激活可能不利于心肌保护。
关键词：钙网蛋白；低氧；缺血预处理；丝裂素活化蛋白激酶
中图分类号：Q463；R329.2+4
Calreticulin expression increases during delayed cardioprotection induced by hypoxic preconditioning
XU Fei-Fei, FU Yan, LIU Feng-Ying, ZHU Xiao-Mei, LIU Xiu-Hua*
Department of Pathophysiology, Chinese People's Liberation Army General Hospital, Beijing 100853, China
Abstract: Both in vivo and cultured cardiomyocyte experiments were performed to investigate the alteration of expression of calreticulin (CRT) during the delayed cardioprotection induced by hypoxic preconditioning (HPC) and the intracellular signal transduction mechanisms of the alteration. (1) Wistar rats were randomly divided into three groups: sham operation group (Sham), myocardial infarction (MI) group induced by left coronary artery ligation and HPC+MI group (4-hour HPC 24 h before MI). Twenty-four hours, 14 d and 28 d after left coronary artery ligation, myocardial function, infarction size and the area at risk were measured. Western blot was used to detect the expression of CRT, the activity of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) and stress-activated protein kinase (SAPK). (2) Cultured cardiomyocytes from neonatal Sprague-Dawley (SD) rat were divided into six groups: hypoxia/reoxygenation (H/R), HPC, HPC+H/R, p38 MAPK inhibitor SB203580+HPC+H/R (SB+HPC+H/R), SAPK inhibitor SP600125+HPC+H/R (SP+HPC+H/R) and control. Survival rate and apoptosis rate of cardiomyocytes 6 h after H/R and activities of lactate dehydrogenase (LDH) in culture medium in each group were measured. Western blot was used to detect the expression of CRT and activities of p38 MAPK and SAPK. The results are as follows: (1) During in vivo experiment, compared with MI group, HPC significantly improved +dp/dtmax and -dp/dtmax, reduced infarction size and the area at risk. HPC dramatically changed the expression of CRT. CRT expression in HPC+MI group was 206% of that in MI group (P<0.05) 24 h after infarction, especially in the area at risk. However, 28 d after operation, the expression of CRT decreased by 57%. Correlation analysis indicated a positive correlation between CRT expression and myocardial function (r=0.9867, P<0.05), and negative correlation between CRT expression and infarction size (r=-0.9709, P<0.05). (2) In cultured cardiomyocytes, HPC attenuated cell injury induced by H/R. CRT expression increased moderately to 222% of control (P<0.05) during HPC, but increased dramatically to 503% of control (P<0.05) after H/R. HPC reduced H/R-induced CRT up-regulation to 56% of that in H/R group (P<0.05). Correlation analysis indicated that CRT expression induced by HPC had a positive correlation with p38 MAPK activity (r=0.9021, P<0.05), but a negative correlation with SAPK activity (r=-0.8211, P<0.05). Both in vivo and in vitro results indicate that HPC protects myocardium from ischemia or H/R injury. p38 MAPK is possibly involved in the up-regulation of CRT induced by HPC, while SAPK has a negative influence.
Key words: calreticulin; hypoxia; ischemic preconditioning; mitogen-activated protein kinase
预先反复短暂缺血可以延缓或减轻组织后续缺血-再灌注 (ischemia/reperfusion, I/R)损伤的现象被称为缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)[1]，这一内源性保护现象广泛存在于心脏、肝脏和小肠等 多种组织器官中。早期研究认为IPC的心脏保护作用仅存在于 IPC后1~3 h之内，即所谓经典的IPC，也称IPC的早期保护作用；1993 年Marber等[2]在家兔在体心脏I/R模型上证实， IPC 24 h后心肌梗死范围较单纯I/R组降低40%~50%，首次提出IPC延 迟保护的概念，亦称为心肌保护的第二窗口(second window of protection, SWOP)。IPC的延迟心脏保护作用包括：缩小I/R后心肌梗死面积、减少恶性 心律失常的发生和改善心肌收缩功能等，该保护现象可以被预先短暂的低氧预处理 (hypoxic precondi-tioning, HPC)模拟[3]，具有良好的临床应用前景。预处理的心脏延迟保护机制涉及内源性保护蛋白合 成和减轻心肌细胞钙超载，阐明介导内源性保护蛋白合成上调和减轻钙超载的细胞分子机制具有十分 重要的意义。钙网蛋白(calreticulin, CRT)是内质网主要的Ca2+结合蛋白，通过协助蛋白质正确折叠和 维持细胞Ca2+稳态而参与调节细胞凋亡、黏附、类 固醇敏感性基因表达和自身免疫反应等。本室以往研究发现 HPC 24 h后，原代培养乳鼠心肌细胞内CRT表达增加[4];有文献报道氧化应激[5]情况下，CRT表达上调，并参与对应激细胞的保护作用。已有研究证实HPC的保护作用涉及减轻I/R损伤和低氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤过程中出现的氧化应激现象[6]，但是 CRT与预处理缺血心肌保护的关系及其机制尚不清楚。本工作分别在 Wistar大鼠心肌梗死模型和原代培养的Sprague-Dawley (SD)乳鼠心肌细胞上，研究HPC延迟保护过程中CRT表达的变化及其信号转导机制。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 红四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)购自上海化学试剂公司；伊文氏蓝为Fluka公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；DTT、EDTA、PMSF、TEMED、leupeptin、b-glycerophosphate、Triton X-100、胰蛋白酶、p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)抑制剂SB203580、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)抑制剂SP600125为 Sigma 产品；蛋白电泳分子量(7~175 kDa)标记为Bio-Rad产品；Annexin V、propidium iodide (PI)为Becton-Dickinson 公司产品，磷酸化p38 MAPK (p-p38 MAPK)和磷酸化SAPK (p-SAPK)抗体为Santa Cruz产品；兔抗小鼠CRT单克隆抗体为Stressgen产品；二抗和增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)检测试剂盒购自Amersham公司；考马斯亮蓝R250 和G250为Amresco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；乳 酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；其余化学试剂为国 产分析纯产品。
1.2 整体动物实验 健康雄性Wistar大鼠(体重250~270 g)术前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组：假手术(sham, n=6)组、仅结扎冠状动脉的心肌缺血 (myocardial infarction, MI)组(n=8)和HPC后再结扎冠状动脉的HPC+MI组(n=8)。MI组动物以2%戊巴比妥钠(0.23 ml/100 g)行腹腔注射麻醉后，经口腔气管插管连接小动物呼吸机(DH-140，浙江 医科大学仪器厂生产)，频率48~54次/min，潮气量1.5~2 ml/100 g，呼吸比1.25:1，术前描记II导联心电图。取胸骨正中切口，钝性分离皮下组织及 肌肉，在胸骨左缘3、4肋间开胸，断第四肋，暴露心脏，打开心包膜，分离左冠状动脉前降支，在 左冠状动脉发出2 mm处用6/0无损伤缝合线结扎冠状动脉，以左前壁苍白及心电图显示ST段抬高为 结扎成功的标志。HPC+MI组大鼠预先置于低氧仓(10% O2 - 90% N2)内4 h后，常规饲养24 h，按MI组程序操作。假手术组大鼠只分离不结扎左冠状动脉，常规关胸，术后正常饮食，定时观察动 物手术切口愈合情况、饮食、皮毛色泽、呼吸等体征。各组均分别于术后24 h、14 d和28 d结束实验。
1.2.1 血流动力学检测 分别于术后24 h、14 d和28 d以上述方法麻醉动物，左侧颈总动脉插管经压力传感器与SMUP-PC1型生物信号处理系统相连。 以MFL Lab200心功能软件(复旦大学上海医学院生理教研室研制)记录心率、颈动脉压和左心室内压。
1.2.2 心肌梗死面积测定 血流动力学检测结束后，开胸、快速摘取心脏并悬挂于Langendorff灌 流装置上，以生理盐水冲洗后灌入1%伊文氏蓝2 ml，去除心房组织后，灌入37℃的2%琼脂，4℃冷却凝固后，切成约2 mm厚的心肌组织切片，以2% TTC染色、10%甲醛固定后，采集图像并以ImageProPlus图像分析软件(Version 4.1, Media Cybernetics, LP, USA)分析心肌组织梗死区、危险区和心肌总面积。
1.3 乳鼠心肌细胞原代培养 无菌操作取出生后24 h内SD乳鼠心脏，以4℃无菌PBS冲洗，分离附着组织后，剪成约1 mm3大小碎块，经0.08%胰蛋白酶37℃反复消化，差速贴壁法 [7]分离去除成纤维细胞等非心肌细胞，制备心肌细胞悬液，加入含 10%胎牛血清和5-溴脱氧核苷(Brdu, 0.01 mmol/L)的DMEM培养基，于37℃、CO2孵箱中原代培养 至对数生长期，进行传代：按6×105个细胞/瓶接 种于50 ml培养瓶用于流式细胞检测；按3×106个细胞/瓶接种于250 ml培养瓶用于蛋白提取。24 h后同步化处理，随机分为6组：(1)H/R组：细胞置于缺氧仓(通入气体为95% N2-5% CO2)内2 h，更换预平衡(37℃、95% O2 - 5% CO2)的无血清培养基后置于细胞培养箱内常氧培养6 h结束实验；(2) HPC+H/R组：按文献报道方法[8]将细胞置缺氧仓内 短暂缺氧20 min，然后按(1)操作；(3) SB203580+ HPC+H/R (SB+HPC+H/R)组：细胞加p38 MAPK抑制剂SB203580 (5 mmol/L)预孵育10 min后，按(2)操作；(4) SP600125+HPC+H/R (SP+HPC+ H/R)组：细胞加SAPK抑制剂SP600125 (25 mmol/L)预孵育10 min后，按(2)操作；(5) HPC组：细胞短暂缺氧20 min，置CO2孵箱37℃常规培养24 h；(6)正常对照组：常规培养24 h。
1.3.1 台盼蓝排斥实验 各组细胞于实验处理结束时以0.125%胰酶消化，收集后离心(1 000 r/min, 10 min)，弃上清，加入1 ml PBS轻轻振荡重悬细胞后，调整细胞浓度，取少量细胞悬液按9:1的比例 加入0.4%台盼蓝染液，静置3 min后，各取10 ml滴于计数板上，按白细胞计数方法分别进行坏死细胞和活细胞计数，计算细胞存活率(活细胞数/总细胞数)。
1.3.2 LDH活力测定 各组细胞于实验结束时收集培养基上清，按照测试盒说明书进行操作，测定各 组细胞培养液中LDH活性。
1.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞经胰酶消化收集后离心，按照试剂盒说明书分别加入Annexin V 10 ml和PI 5 ml，室温下孵育15 min，采用BD FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickin-son公司)，测定各组细胞凋亡情况。
1.4 CRT表达及p38 MAPK、SAPK活性测定 按本室以往报道的方法[9]提取心肌组织或心肌细胞总蛋 白，Bradford法蛋白定量后分装、-70℃保存。取上述细胞蛋白提取液上清30 ml (含蛋白30 mg)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%分离胶)，将电泳分离后的 蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭、洗脱后分别加入兔抗小鼠CRT多克隆抗体(1:200)或兔抗小 鼠p-p38 MAPK或p-SAPK多克隆抗体(1:500)孵育4 h，洗膜后以相应的二抗孵育1 h，抗原-抗体复合物用ECL法显示，暗室X光胶片曝光，采用Image- ProPlus软件(Version 4.1, Media Cybernetics, LP, USA)分析照片中蛋白条带的灰度。
1.5 统计学处理 实验数据以mean±S D表示，组间比较采用方差分析(analysis of variance, ANOVA); 分别对CRT蛋白表达量与心功能、梗死面积、p38 MAPK及SAPK活性作相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2.1 HPC对Wistar大鼠血流动力学的影响
冠状动脉结扎术后不同时间血流动力学资料分析可见，实验各组大鼠心率和平均动脉压无显著性 差异(表1)。阻断冠状动脉左前降支后MI组心室收缩(+d p/dtmax)与舒张(-dp/d tmax)功能均明显下降，与假手术组比较，术后24 h、14 d和28 d，+dp/dtmax分别下降62% (P<0.01)、45% (P<0.05)和41% (P<0.05); -dp/dtmax分别下降61% (P<0.01)、35% (P< 0.05)和36% (P<0.05)。HPC可明显改善缺血后心功能，与MI组比较，术后24 h、14 d和28 d，+dp/dtmax分别升高86% (P<0.01)、59% (P<0.05)和46% (P< 0.05); -dp/dtmax分别升高84% (P<0.01)、42% (P< 0.05)和50% (P<0.05); 另外，经HPC后心功能恢复较快，术后14 d HPC组眃p/dtmax已恢复至接近正 常水平，与假手术组相比无显著差别(P>0.05)，而 该时间点上MI组+dp/dtmax和-dp/dtmax仍分别较假手术组低45%和35% (P<0.05)。
2.2 HPC对Wistar大鼠心脏梗死面积的影响
实验各组心肌梗死面积见图1。在图1A的组织切片中，蓝色区域为正常心肌，TTC染色阳性的砖红色区域为危险区心肌，TTC染色阴性的灰白色 为梗死心肌。以ImageProPlus软件分析危险区、梗死区及心肌总面积，计算梗死区占危险区的比例可 以看出，MI组与HPC+MI组危险区占心肌总面积百分比无明显差异 (P>0.05); 结扎左冠状动脉前降支可造成明显的心肌梗死，MI组动物术后 24 h、14 d和28 d心肌梗死区占危险区面积的百分比分别为 61.67%、59.08%和58.55% (假手术组动物无心肌梗死); HPC明显限制MI后心肌梗死范围，与MI组比较，HPC组动物于术后24 h、14 d和28 d时梗死区占危险区面积的百分比分别下降30.76%、26.55% 和15.82% (P均<0.05)。
2.3 HPC对SD乳鼠心肌细胞存活率的影响
台盼蓝排斥实验结果显示：对照组细胞存活率为96.0%； H/R使细胞存活率降低，复氧6 h细胞存活率较正常对照组低11.8% (n=4, P<0.05); HPC可明显减轻H/R造成的细胞坏死，蓝染细胞数明显减少， HPC+H/R组细胞存活率较H/R组升高6.4% (n=4, P<0.05); 与HPC+H/R组相比，应用p38 MAPK抑制剂SB203580的SB+HPC+H/R组细胞存活率降低5.4% (n=4, P<0.05); 应用SAPK抑制剂SP600125的SP+HPC+H/R组与HPC+H/R组细胞存活率无明显差别(图2)。
2.4 LDH活性测定
H/R可导致细胞LDH漏出，复氧6
h细胞培养基中LDH活性较对照组升高504% (n=3,
P<0.05);
HPC可明显减轻H/R造成的LDH漏出，HPC+H/R组LDH活性较H/R
组降低59% (n=3, P<0.05);
与HPC+H/R组相比，应用p38
MAPK抑制剂SB203580的SB+HPC+H/R组LDH活性升高128%
(n=3, P<
0.05)，应用SAPK抑制剂SP600125的SP+HPC+H/R组升高61%
(n=3, P<0.05)(图2)。
2.5 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率
流式细胞仪检测结果显示：正常对照组细胞存活率为95.79% ，凋亡率为2.52%；H/R可致细胞明显损伤，复氧6 h细胞存活率较正常组降低23.16%， 凋亡率较正常组升高6.96%；HPC可明显减轻H/R所致细胞凋亡，存活率较 H/R组升高17.41%，凋亡率较H/R组下降4.6%；与HPC+H/R组相比，应 用p38 MAPK抑制剂SB203580的SB+HPC+H/R组细胞存活率降低5.65%，凋亡率升高3.93%(P均< 0.05); 应用SAPK抑制剂SP600125的SP+HPC+H/R组与HPC+H/R组相比，细胞存活率及凋亡率无明显改变(P>0.05)(图3)。
2.6 Western blot检测结果
2.6.1 Wistar大鼠心肌梗死模型CRT表达及p38 MAPK、SAPK活性变化
2.6.1.1 HPC对CRT表达的影响
冠状动脉结扎术后24 h，MI组与假手术组危险区比较，CRT表达量增高52% (P<0.05); MI组的梗死区、危险区和非缺血区比较，无明显差异(P>0.05); HPC+MI组与MI组危险区比较，CRT表达量增高106%(P<0.05); HPC+MI组的梗死区、危险区和非缺血区比较，危险区CRT表达分别较梗死区和 非缺血区高50%和38% (P<0.05)，而梗死区与非缺血区之间无显著差异(P>0.05)。术后14 d，假手术、MI和HPC+MI各组间及组内不同区域比较时，心肌组织 CRT表达量均无显著差异(P>0.05)。术后28 d，MI组危险区CRT表达量比假手术组增高80% (P<0.05); MI组不同区域比较，无显著差异(P>0.05); HPC+ MI组CRT表达量比MI组低57% (P<0.05)，与假手术组无显著差异(P>0.05) 。结果见图4。
2.6.1.2 HPC对p38 MAPK及SAPK活性的影响
冠状动脉结扎术后24 h，MI组与假手术组危险区比较，p38 MAPK活性增高37% (P<0.05); MI组的梗死区、危险区和非缺血区比较时，无显著差异(P>0.05); HPC+MI组危险区p38 MAPK活性较MI组、假手术组分别高106%和179% (P<0.05)，而HPC+MI组的梗死区、危险区和非缺血区比较时， 危险区p38 MAPK活性较梗死区和非缺血区分别高20%和13%(P<0.05)。术后14 d，各组间及组内不同区域间比较，p38 MAPK活性均无显著差异(P>0.05)。术后28 d，MI组危险区p38 MAPK活性比假手术组高28%(P<0.05); MI组不同区域比较，无显著差异(P>0.05); HPC+MI组危险区p38 MAPK活性比MI组低26% (P<0.05)，与假手术组比较无显著性差异(P>0.05)。
冠状动脉结扎术后24 h，MI组SAPK发生磷酸化激活，而假手术组SAPK未发生磷酸化；MI组的梗死区、危险区和非缺血区比较时，无显著差异(P>0.05); HPC+MI组SAPK激活，但活性较MI组低48%(P<0.05); HPC+MI组的梗死区、危险区和非缺血区比较时，SAPK活性无明显差异(P>0.05);术后14d，HPC+MI组和对照组SAPK无活性，MI组SAPK磷酸化亦降低(P<0.05); 术后28 d，各组各部位心肌组织内均未检测到磷酸化的SAPK信号。结果见图5。
2.6.2 SD乳鼠心肌细胞CRT表达及p38 MAPK、SAPK活性变化
2.6.2.1 HPC对CRT表达的影响
单纯H/R或HPC均可诱导CRT表达增加，与正常组相比，CRT表达量分别增高403%或122% (n=3, P<0.05); HPC可降低H/R诱导CRT表达升高的幅度，与H/R组相比，HPC+H/R 组CRT表达量降低56% (n=3, P<0.05); 应用SB203580后，CRT表达量较HPC+H/R组降低22% (n=3, P<0.05); 应用SP600125后，CRT表达量较HPC+H/R组升高44% (n=3, P<0.05)(图6)。
2.6.2.2 HPC对p38 MAPK及SAPK活性的影响
HPC可诱导p38 MAPK活性增加，HPC组和HPC+H/R组分别较对照组升高144%和50% (n=3, P< 0.05); H/R组p38 MAPK活性较对照组降低53% (n=3, P<0.05)。
H/R诱导SAPK活化，与正常组相比，SAPK活性增加232%(n=3,P<0.05); HPC可降低H/R诱导的SAPK活化，与H/R组比较，HPC+H/R组SAPK 活性降低44% (n=3, P<0.05)(图6)。
2.7 相关分析
采用Stata统计软件分别对Wistar大鼠心肌梗死模型术后不同时间点CRT表达量与心功能、梗死面
积，以及SD乳鼠心肌细胞HPC诱导CRT表达与p38
MAPK、SAPK活性进行相关分析。Wistar大鼠心肌梗死模型术后24 h
CRT表达量与心功能呈正相关(r = 0.9867,
P<0.05)，与梗死面积呈负相关(r =
-0.9709, P<0.05); 术后14d和28 d，CRT表达量与心功能、梗死面积无明显相关性。SD乳鼠心肌细
胞HPC诱导CRT表达与p38 MAPK活性正相关(r = 0.9021,
P<0.05)，与SAPK活性呈负相关(r = -0.8211,
P<0.05)。
3 讨论
1986年Murry等[1]首次提出IPC的概念，其保 护作用具有时相性，包括预处理后即刻出现并持续1~3 h的早期保护和12~24 h再度出现并持续24~72 h的延迟保护[2]，其中延迟保护作用具有更重要的 临床意义，可以调动机体内源性保护机制，释放内源性保护因子，明显减轻缺血时心肌细胞的损害，缩小梗死面积，改善心肌收缩与舒张功能。Engelman等 [10]报道，HPC可改善大鼠离体灌流心脏I/R后左心室收缩功能，并减少心肌细胞内 LDH的漏出。
本实验在Wistar大鼠心肌梗死模型上证实，HPC可明显改善心肌梗死后心脏的收缩与舒张功 能，表现为左心室压力最大上升/下降速度(±dp/dtmax)明显高于MI组；结扎左冠状动脉前降支造成心肌梗死后 24 h，MI组与HPC+MI组危险区占心肌总面积百分比无显著差异 (P>0.05)，表明各组冠状动脉结扎部位相对恒定，心肌梗死模型复制成功；而 HPC+MI组梗死区占危险区面积百分比在术后24 h、14 d和28 d均低于MI组，表明HPC可限制心肌梗死范围。值得注意的是，尽管术后24 h MI组与HPC+MI组危险区占心肌总面积百分比无显著差异，但是在术 后14 d和28 d，HPC+MI组危险区占心肌总面积百分比较MI组降低，表明 HPC可促进危险区心肌恢复，与文献报道的预处理保护作用一致 [10]。
原代培养的SD乳鼠心肌细胞上证实，HPC可减少H/R诱导的心肌细胞内LDH漏出，增加细胞存活率，阻止细胞凋亡，与文献关于HPC可增强细胞对H/R损伤的抵抗，增加细胞膜稳定性的报道一 致[11]。
预处理的延迟保护机制尚未完全阐明，现有研究结果显示内源性保护性蛋白合成、内质网Ca 2+稳态调节及细胞凋亡抑制等均参与预处理的保护作用。CRT (46 kDa)是内质网Ca2+结合蛋白，参与调节细胞Ca2+稳态和内质网的Ca2+储存能力[12]，是蛋白质合成撝柿靠刂茢的重要分子伴侣[13]，还参与调节细胞凋亡[14]、细胞黏附[15]、类固醇敏感性基因表达[16]和自身免疫[17]等多种细胞功能。Hung等[5]发现在内质网应激时，肾脏内皮细胞中CRT过表达可 抑制内质网Ca2+释放，减轻胞浆Ca2+超载，增强细胞对H2O2诱导损伤的抵抗力；但亦有报道CRT过表达增加细胞对应激的敏感性，促进凋亡[14,18]。本室以往研究发现HPC 24 h后心肌细胞内CRT表达增加[4]，但对于该蛋白表达增加的病理生理学意义尚不清楚。
本研究发现心肌梗死术后24 h MI组CRT表达高于假手术组，而HPC进一步诱导CRT表达上调 (以危险区最为明显)，明显高于MI组，相关分析显示，术后24 h HPC+MI组CRT表达量与心功能呈正相关，与梗死面积呈负相关。结合术后24 h HPC+ MI组危险区CRT表达高于梗死区和非缺血区的结果，我们推测，在心肌梗死早期，HPC通过诱导CRT表达上调，有利于心肌内源性保护蛋白折叠、调节细胞Ca 2+稳态，促进危险区心肌恢复，而发挥其心脏保护作用。但术后14d HPC+MI组CRT表达逐渐下降，28d时降至假手术组的基础水平，而MI组心肌组织CRT持续高表达，术后14 d和28 d时均明显高于HPC+MI和假手术组，提示心肌梗死可能诱导严重的内质网应激，通过内质网相关性死亡(ER-associated death, ERAD)途径造成细胞凋亡，加重心肌损伤。
本研究在原代培养的SD乳鼠心肌细胞上发现，单纯短暂低氧可诱导CRT表达适度增加，而损伤性 HR诱导CRT高度表达，HPC则可降低H/R诱导CRT表达升高的幅度，由此推测HPC诱导CRT表达适 度上调，可能通过增加内质网Ca2+结合能力，减少应激时Ca2+从内质网向胞浆的大量释放，从而减轻 钙超载对心肌细胞的损伤作用；长时间H/R导致CRT过表达，则可能由于Ca 2+调节失衡(如结合过量Ca2+、促进SERCA2a的降解和失活[18]等)或影响其他分子信号途径(如活化calcineurin[19]、抑制Akt信号转导途径[14])而造成细胞损伤；HPC可能通过 诱导CRT适度表达，增强心肌细胞对H/R损伤的抵抗力，避免H/R诱导的CRT过表达而发挥心肌保护 作用。
有研究证实CRT主要分布于内质网，H/R刺激如何通过信号分子介导CRT表达的信号转导途径尚 未阐明。已有研究[20]证实预处理引起腺苷、缓激肽 等内源性保护介质释放增多，直接或间接地引起MAPKs激活，诱导内源性保护蛋白合成而发挥心肌 保护作用。本工作在大鼠心肌梗死模型上发现冠状动脉结扎术后24 h p38 MAPK磷酸化增强，而SAPK磷酸化减弱；为了进一步验证p38 MAPK/SAPK途径是否介导HPC诱导的CRT早期表达上调，我们对原代培养SD乳鼠心肌细胞分别应用p38 MAPK和SAPK的抑制剂，研究其对HPC诱导CRT表达的影响，发现CRT表达与p38 MAPK磷酸化呈正相关，与SAPK磷酸化呈负相关，提示p38 MAPK/SAPK途径介导了HPC诱导CRT适度表达上调。
SAPK又称为c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)，是MAPKs家系成员，可被应激刺激、细胞因子等激活，使核转录因子c-Jun、Elk- 1和ATF2等磷酸化，增强其转录活性[21]。p38 MAPK在1993年由Brewster等发现，是MAPKs的亚类之一，其性质与SAPK相似，同属应激激活的 蛋白激酶，二者激活后的生物学意义尚未完全阐明。有研究认为p38 MAPK参与预处理延迟保护作用，Dana等[22]报道选择性腺苷A1受体激动剂CCPA 诱导新西兰兔心脏预处理现象，p38 MAPK活性明显增加，诱导热休克蛋白HSP25/27磷酸化，限制 心肌梗死面积，发挥细胞保护作用。SAPK在预处理中的作用尚存在争议，有研究 [223]报道在离体灌注大鼠心脏模型上I/R造成MAPKs家系三种激酶活性 都升高，IPC使细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERKs)和p38 MAPK进一步激活，而SAPK活性无升高趋势，未参与IPC保护机 制。Yue等[24]报道家兔心肌I/R引起缺血区SAPK活 化，上调Fas蛋白表达，诱导细胞凋亡。上述资料提示，p38 MAPK和SAPK在预处理过程中可能具有相反的作用，前者有利于细胞保护，而后者则 参与细胞损伤，本研究结果与文献[22,24]报道一致。
本研究发现HPC诱导的CRT适度表达与p38 MAPK磷酸化正相关，与SAPK磷酸化负相关，提示p38 MAPK/SAPK途径介导了HPC诱导的CRT表达上调，但HPC诱导CRT表达上调与心肌保护作 用的相关机制有待于进一步研究。
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