研究论文
血管紧张素Ⅱ受体阻断对心肌成纤维细胞信号转导相关基因表达谱的影响
蒋小英1，高广道2,*，王新凤 2，林元喜2，王亚文2，杨予白 2
西安交通大学医学院1遗传学与分子生物学系； 2生理学与病理生理学系，西安710061
摘 要：为了研究血管紧张素Ⅱ (angiotensin II, Ang II)受体在成年大鼠心肌成纤维细胞的信号转导机制，分离及培养成年 Sprague-Dawley大鼠心肌成纤维细胞，采用免疫组化染色测定Ang Ⅱ受体的蛋白表达。将细胞随机分为四组进行药物干预48 h：AngⅡ组、AngⅡ+ losartan 组、AngⅡ+ PD123319组和AngⅡ+ losartan + PD123319组。抽提mRNA制备cDNA探针，与G蛋白耦联受体信号通路发现者基因芯片杂交，筛选表达差异的基因。发现血管紧张素Ⅱ1型(angiotensin II type 1, AT1)受体被losartan阻断后，AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞血管紧张素Ⅱ2型(angiotensin II type 2, AT2)受体蛋白高表达；34个基因表达差异在2倍以上，30个下调，4个上调，其最大改变不超过20倍；9条信号通路被活化：cAMP/PKA、 Ca2+、PKC、PLC、MAPK、PI-3K、NO-cGMP、Rho、NF- kB通路。当AT2受体被PD123319阻断时，64个基因表达差异在2倍以上，48个下调，16个上调；11条途径基础活化，其中7个基因的改变在30倍以上：Cyp19a1 (37倍)、Il1r2 (42倍)、Cflar (53倍)、Bcl21 (31倍)、Pik3cg (278倍)、Cdkn1a (90倍)、Agt (162倍)。在AT1受体阻断的基础上再阻断AT2受体，46个基因表达差异在2倍以上，36个下调，10个上调；11条信号途径全部活化。其结果与单独阻断 AT2受体信号途径基本一致。RT-PCR选取IL-1b和TNF-a进行验证，结果与芯片各组间的变化趋势基本相符。结果表明， 在成年大鼠心肌成纤维细胞，AT2受体阻断明显不同于AT1受体阻断，在信号转导通路相关基因表达谱上，两者有显著 差异。
关键词：心肌成纤维细胞；AT2受体；cDNA芯片
中图分类号：R363.2+1
Alteration of signal transduction-associated gene expression in rat cardiac fibroblasts induced by blocking angiotensin II receptors
JIANG Xiao-Ying1, GAO Guang-Dao2,* , WANG Xin-Feng2 , LIN Yuan-Xi2, WANG Ya-Wen2 , YANG Yu-Bai2
1Department of Genetics and Molecular Biology; 2Department of Physiology and Pathophysiology, Medical College of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China
Abstract: To investigate the molecular mechanism of angiotensin II (Ang II) receptor activation in adult rat cardiac fibroblasts, the expressions of cell signal transduction-associated genes were studied by using cDNA microarray. Cardiac fibroblasts of adult Sprague-Dawley rats (230~250 g) were isolated and cultured. The cells were divided into 4 groups: Ang II, Ang II + losartan, Ang II + PD123319, Ang II + losartan + PD123319. The expressions of Ang II receptors were studied by immunohistochemical staining. Total RNA was extracted and purified. After cDNA synthesis and biotin-16-dUTP labeling, the probes were denatured and hybridized with GEArray Q Series mouse G Protein-coupled Receptors Signaling Pathway Finder Gene Array (MM-025) containing 96 genes associated with 11 pathways. The arrays were scanned with a Uniscand1000 scanner and further analyzed with GEArray Analyzer software. RT-PCR was used to further confirm the results of gene microarray. The results of immunohistochemical staining showed that the expression of Ang II type 2 (AT2) receptor was evidently induced by Ang II stimulation when Ang II type 1 (AT1) receptor was blocked. The results of gene array indicated that blocking AT1 receptor changed 34 genes (more than 2 folds), 30 were down-regulated and 4 were up-regulated. The maximum change was not beyond 20 folds. The following 9 pathways were activated: cAMP/PKA, Ca2+, PKC, PLC, MAPK, PI-3 kinase, NO-cGMP, Rho, NF-kB pathways. Blockade of AT2 receptor caused 64 genes changing more than 2 folds (48 were down-regulated and 16 were up-regulated). Eleven pathways were basically activated. The change of the following 7 genes was over 30 folds: Cyp19a1 (37 folds), Il1r2 (42 folds), Cflar (53 folds), Bcl21 (31 folds), Pik3cg (278 folds), Cdkn1a (90 folds), Agt (162 folds). According to the activated extent, the signal transduction pathways in turn were PI-3 kinase, NF-kB and JAK-STAT pathways. Blocking both AT1 and AT2 receptors changed 46 genes more than 2 folds (36 were down-regulated and 10 were up-regulated). Eleven pathways were basically activated. The results of RT-PCR of IL-1b and TNF-a confirmed the observations in gene microarray. Our results show that Ang II can induce a high expression of AT2 receptor in adult rat cardiac fibroblasts when AT1 receptor is blocked, and the signal mechanism of AT2 receptor is clearly different from that of AT1 receptor.
Key words: cardiac myoblasts; receptor, angiotensin, type 2; cDNA microarray
研究表明，心肌肥厚及慢性心衰的主要病理生理机制是进行性发展的心肌重塑(cardiac remodeling)。心肌重塑主要表现为心肌组织细胞表型改变、心肌 细胞肥大、成纤维细胞增生和胞外基质蛋白(胶原纤维)沉积。研究证实心肌内源性肾素-血管紧张素 系统(renin-angiotensin system, RAS)在心肌重塑的发生、发展中起着重要的调控作用 [1]。血管紧张素Ⅱ (angiotensin II, Ang II)是RAS主要的活性物质，主要通过AT1和AT2受体(angiotensin II type 1 and 2 receptors)发挥效应[2]。研究发现AngⅡ可促使心肌 成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)增殖，合成分泌胶原等细胞外基质成分，介导间质纤维化而参与 心肌重塑[3]。AngⅡ刺激CFs还可分泌多种细胞因子，这些因子以旁分泌或自分泌的方式调控CF自身和周围的心肌细胞代谢结构功能而参与心肌重塑 [4]。AngⅡ对CFs介导的多种生物学效应，目前认为是 由AT1受体介导。临床应用AT1受体拮抗剂防治高血压和心衰已取得较好的近期疗效。但在AT1受体 被抑制的同时，必将使AT2受体的作用增强，然而AT2受体的作用及分子机制目前尚未阐明 [5,6]。有文献报道AT2受体具有与AT1受体相拮抗的生长抑 制效应，在心肌梗死中具有心肌保护作用。然而AT2受体在心肌肥大及重塑中的作用，目前尚未定 论。我们在本室多年对AngⅡ及心肌重塑研究的基础上，采用基因芯片的方法，研究不同受体阻断后 CFs信号通路基因表达谱的改变，探求AT2受体在CFs的信号转导机制，寻找成年大鼠CFs中AT2和 AT1受体的差异。
1 材料与方法
1.1 材料 雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重230~250 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。胶原酶Ⅰ、胰蛋白酶、AngⅡ和PD123319 (Sigma公司); losartan (Du Pont & Merk Pharmaceuticals 公司); TRIzol、DMEM (Gibco公司); MMLV反转录酶、RNase抑制剂、逆转录试剂盒、Taq 聚合酶、dNTP 和PCR 试剂(Promega 公司); 生物素-16-dUTP 购自Roche公司；芯片系美国Superarray公司GEArray Q系列小鼠G蛋白耦联受体信号通路发现者基因芯片(MM-025)，芯片的基因分布图及相 关信息可从公司的网站检索到(www.superarray.com); 兔抗大鼠AT2多抗(武汉博士德公司)。
1.2 方法
1.2.1 成年SD大鼠CFs的分离及培养
采用本室已建立的胶原酶Ⅰ、胰蛋白酶消化及差速贴壁的方法 [3]分离培养原代CFs。培养条件为37℃、5% CO2。细胞在含20% 胎牛血清的DMEM中培养至亚融合状态，经12 h无血清预适应后，进行药物干预。
1.2.2 免疫组化染色测定AT2受体蛋白表达 将细胞培养在玻片上，分为对照组、AngⅡ (1×10-6 mol/L)组、losartan (1×10-5 mol/L)组、AngⅡ (1×10-7 mol/L) + losartan (1×10-5 mol/L)组、AngⅡ1×10-6 mol/L) + losartan (1×10-5 mol/L)组、AngⅡ(1×10-5 mol/L) + losartan (1×10-5 mol/L)组。药物干预作用48 h，进行常规免疫组化操作(ABC法)。即以抗生物素的过氧化物酶反应检测，依次加入兔抗大鼠AT2多克隆抗体(一抗)、生物素标记的羊抗兔IgG (二抗)、DAB显色、复染和封片。
1.2.3 基因芯片检测AngⅡ受体阻断后的信号分子表达变化
1.2.3.1 药物干预 细胞随机分为四组，进行药物干预AngⅡ (1×10-5 mol/L)、AngⅡ (1×10-5 mol/L) + losartan (1×10-5 mol/L)、AngⅡ (1×10-5 mol/L) + PD123319 (1×10-5 mol/L)、AngⅡ (1×10-5 mol/L) + losartan (1×10-5 mol/L) + PD123319 (1×10-5 mol/L)，药物作用48 h后收集细胞。losartan是AT1受体特异性阻断剂，PD123319是AT2受体特异性阻断剂。
1.2.3.2 细胞总RNA的抽提和测定 按TRIzol一步法抽提细胞总RNA，测量其260 nm和280 nm下的光吸收值，并计算其比值以及溶液浓度。
1.2.3.3 探针标记 先将GEArray标记混合液42℃孵育1 min，加10 ml到42℃孵育的退火混合物10 μl (含总RNA 5 mg)中，混匀，42℃ 90 min。标记反应液(10 μl/样品)含标记混合液4 μl、生物素-16-dUTP 2 μl、RNase抑制剂1 μl、MMLV反转录酶1 μl和无RNase的纯水2 μl。将标记好的cDNA探针溶液置于94℃预变性5 min，迅速冰浴冷却待用。
1.2.3.4 杂交 加5 ml去离子水至杂交管将芯片膜完全湿润，将水弃去；加2 ml 60℃预热的预杂交液，60℃下6 r/min预杂交1.5 h；加已变性的cDNA探针入预杂交液，60℃下6 r/min杂交过夜。洗膜。
1.2.3.5 化学发光法检测芯片杂交结果 加1.5 ml的GEAb封闭液Q入杂交管，室温下孵育40 min；去除封闭液，加2 ml稀释的AP结合缓冲液，温和振荡10 min； 洗膜4次；加1.0 ml CDP-Star化学发光底物入杂交管，室温下静置2 min，检测芯片的杂交结果。取出芯片，用X-射线胶片曝光。
1.2.3.6 芯片数据分析 用紫光uniscan d1000扫描仪扫描芯片，获取基因表达的信号强度值，用Scanalyzer软件对扫描图像进行数字化处理，用芯片配套软件GEArray Analyzer对获取的原始信号进行均衡和修正。用内参照基因(β-actin、GAPDH、cyclophilin A和RPL13A)进行校正，并对每个基因的4个重复点进行平均。然后进行样品间基因表达 丰度的分析。判断基因差异表达的筛选标准：比值>2.0 (上调2倍)或<0.5 (下调2倍) 。
1.2.4 半定量RT-PCR 采用TRIzol一步法提取细胞中的RNA，以5 mg总RNA进行逆转录合成cDNA，用不同引物分别进行30个循环的扩增(94℃， 1 min；退火温度，1 min；72℃，1 min); 72℃延伸5 min。引物的设计采用Primer 5软件，序列及各对引物的退火温度如表1。PCR产物取8 ml，在2%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统对条带灰度进行分 析。以目的基因与内参照β-actin的光密度(optical density)比值作为半定量指标。
1.3 统计学分析 数据以mean±SD表示，组间比较采用t检验，P <0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 免疫组化结果
在对照组、AngⅡ (1×10-6 mol/L)组、losartan (1×10-5 mol/L)组和AngⅡ (1×10-7, 1×10-6, 1×10-5 mol/L) + losartan (1×10-5 mol/L)组，仅在最后一组AngⅡ浓度变为1×10-5 mol/L 时AT2受体才呈现高表达(图1)，其余各组均没有AT2受体表达，呈阴 性结果(结果未示)。光镜下AT2受体的阳性染色呈淡棕色、条状分布，主要位于CFs膜上。
2.2 细胞总RNA 质量
AngⅡ处理组OD260/OD280为1.83、AngⅡ+ losartan组OD260/OD280为1.82、AngⅡ+ PD123319组OD260/OD280为1.94、AngⅡ+ losartan + PD123319组OD260/OD280为1.87。它们与电泳分析结果共同表 明，本实验得到了高纯度的RNA，完全符合实验要求。
2.3 基因芯片结果
AngⅡ处理组、AngⅡ+ losartan组、AngⅡ+ PD123319组、AngⅡ+ losartan + PD123319组芯片图像结果见图2。
AngⅡ+losartan组与AngⅡ组比较显示AT1受体阻断后，34个基因表达差异在2倍以上(表2)， 其中30个下调，4个上调。其最大改变不超过20倍。9条信号通路被活化：cAMP/PKA (Rgs2、Vegfa、Ptgs2); Ca2+ (Elk4、Ccl2、Ccl4); PKC (Jun、Mmp9、Myc、Nos2、Npy、Agtr2); PLC (Icam1); MAPK (Fgf2、Ccl2); PI-3K (Akt1); NO-cGMP (Tnf、RIKEN cDNA 4933430F08 gene ); Rho (Ctgf、Il1b); NF-kB (Csf3、Il2)通路。AngⅡ+ PD123319组与AngⅡ组比较显示AT2受体阻断后，64个基因表达差异在2倍以上(表3)，48个下调， 16个上调。11条途径基础活化，其中7个基因的改变在30倍以上：Cyp19a1 (37倍)、Il1r2 (42倍)、Cflar (53倍)、Bcl21 (31倍)、Pik3cg (278倍)、Cdkn1a (90倍)、Agt (162倍)。AngⅡ+ losartan + PD123319组与AngⅡ+ losartan组比较显示在AT1受体阻断的基础上再阻断AT2受体后，46个基因表达 差异在2倍以上，36个下调，10个上调。11条途径基础活化。其中除Ptgs2 (235倍)、Agtr2 (81倍)、Il1β (8倍)、Tnf (7倍)，其余改变均在3倍左右。
2.4 RT-PCR鉴定结果
我们选取2个感兴趣的基因IL-1β和TNF-α作RT-PCR验证。IL-1β和TNF-α的RT-PCR产物凝胶电泳图分别见图3、4。芯片检测结果表明，IL-1β在AngⅡ组、AngⅡ+ losartan组、AngⅡ+ PD123319组、AngⅡ+ losartan + PD123319组的表达水平分别是2.209E-2、7.068E-3、4.225E-2、8.450E-4。 AT1受体阻断，IL-1β下调3.125倍；AT2受体阻断，IL-1β上调1.9倍，共阻断下调26倍。RT-PCR显示：AT1受体阻断，IL-1β下调5%；AT2受体阻断，IL-1β上调37%，共阻断下调46% (P<0.05)。TNF-α在四组的表达水平是2.143E-1、8.415E-2、 4.587E-2、1.232E-2。AT1受体阻断，TNF-α下调2.55倍；AT2受体阻断，TNF-α下调4.67倍，共阻断下调17倍。 RT-PCR显示：AT1受体阻断，TNF-α下调26%；AT2受体阻断，TNF- α下调37%，共同阻断下调44% (P<0.05)。RT-PCR验证结果与芯片的筛查结果趋势基本相符。
3 讨论
AT1和AT2受体均属G蛋白耦联受体。AT1受体由359个氨基酸组成，AT2 受体由363个氨基酸组成，二者之间有32%~35%的同源性。AT1 受体分布广泛，而AT2受体在成人机体仅限于几个器官的低水平表达(如脑、心脏等)，AT2受体在组织重 塑和炎症中表达增强，蕴涵着AT2受体可能的病理意义[2]。AT2与AT1受体在心肌重构中可能介导不同的作用。文献报道在压力超负荷诱导的心肌肥厚 模型中，冠状动脉的增厚和血管壁纤维化，在Agtr2- 小鼠明显加强，而在过表达小鼠显著减弱，且AT1受体阻断剂抑制纤维化的效应在Agtr2-鼠明显减弱，说明AT2受体参与了AT1受体阻断剂介导的抑制间质纤维化效应[7]。在Wistar-Kyoto老龄鼠 心肌肥厚模型中，AT2受体部分介导了AT1受体阻断剂的抗肥大效应[8]。说明AT2受体可能参与改善心肌重构的过程，然而其确切作用及机制尚不明 确。本研究在基因水平对成年CFs中AT1与AT2受体阻断后的信号转导相关基因表达谱进行研究，进而探求AT2受体在CFs的信号转导机制，明确AT2和AT1受体的差异。
本研究在我室以往研究的基础上，先用免疫组化发现：AngⅡ (1×10-5 mol/L) + losartan (1×10-5 mol/L)作用CFs 48 h后，AT2受体蛋白高表达。表明AT1受体阻断后，高水平的AngⅡ可诱导CFs的 AT2 受体蛋白高表达，随后的基因芯片结果也显示AT1受体阻断后，AT2受体基因上调20倍。说明 高水平的AngⅡ从转录水平上调AT2 受体的表达。CFs的AT2受体在蛋白质水平的高表达必将使AT2受 体的作用加强，放大AT2受体的信号转导效应。
AngⅡ作用于CFs上的AT1受体，可促进CFs增殖和胶原蛋白合成，介导间质纤维化而参与心肌间质重塑[9]。AngⅡ对CFs的这些效应是通过CFs胞 内信号途径介导的。AT1受体通过Gq蛋白激活PLC，水解PIG2生成IP3和DG2，使胞内Ca2+增加，活化PKC介导生物学效应。AT1受体本身虽然不具有 内源性酪氨酸激酶样活性，但与AngⅡ结合后却能启动细胞内酪氨酸磷酸化的级联反应。AT1受体在 与AngⅡ结合后激活ERK和Ras，还可激活JNK和p38 MAPKs的信号转导通路[10]。AT1受体还可通过Gi蛋白抑制腺苷酸环化酶活性，从而抑制cAMP/PKA途径[11]。有报道在人CFs，AngⅡ结合AT1受体，通过Ca2+敏感性的PKC-依赖性酪氨酸激酶途径，刺激细胞蛋白质合成过程 [12]。Abbasi等报道MEKK3参与AT1受体活化后的calcineurin/NFAT途径[13]。本研究结果提示：losartan阻断AT1受体后(AngⅡ+ losartan组与AngⅡ组比较)34个基因表达改变2倍以上，其最大改变不超过20倍。涉及9条信号通路活化：cAMP/PKA (Rgs2、Vegfa、Ptgs2); Ca2+ (Elk4、Ccl2、Ccl4); PKC (Jun、Mmp9、Myc、Nos2、Npy、Agtr2); PLC (Icam1); MAPK (Fgf2、Ccl2); PI-3K (Akt1); NO-cGMP (Tnf、RIKEN cDNA 4933430F08 gene); Rho (Ctgf、Il1b)，NF-kB (Csf3、Il2)通路。 本研究结果表明，AT1受体在CFs的信号转导机制较为复杂，涉及多条信号转导通路的活化。各条途径之间的交互作用需要进一步研究。Seta等报道AT1受体Tyr-319的磷酸化介导Ang Ⅱ引起的表皮生长因子受体的跨活化[14]。本研究结果提示：AT1受体阻断同时调节了多种G蛋白耦联受体(Adrb 2、Edg2、Edg3、Gnrhr、Gprc1a、Grm8、Grm6、Lhcgr、Arr b2、Ptgdr、Tshr)的表达，其详细机制有待进一步研究。
对于AT2受体的信号转导途径没有AT1受体研究得广泛。有报道心肌AT2受体通过kinin/NO机制 抑制间质纤维化[15]。不同于AT1受体，AngⅡ结合 AT2受体并不影响细胞内cAMP水平，但在不同细胞cGMP水平会增高或降低，且cGMP水平受NO 调控。Pulakat等报道AT2受体胞内第二、三个环与细胞内cGMP的水平相关 [16]。AT2受体不同于AT1受体，在细胞内不活化PLC。有报道心脏AT2 受体参与心脏肥大的调节，且PKC信号途径参与此作用 [17]。在PC12W细胞AngⅡ结合AT2受体，通过活化酪氨酸蛋白磷酸酶抑制鸟苷酸环化酶，降低 细胞内cGMP水平[18]。AT2受体能激活许多磷酸酶 如SHP-1、MKP-1、PP2A等。AngⅡ通过AT2受体激活MKP21和PP2A活性而抑制ERK1/2 [19]。有报道AngⅡ刺激AT2受体后下游信号途径是calci neurin/NF-AT/eNOS途径[20]。Andresen等报道 AT2-AT1受体的交互作用是由NO和RhoA机制介导[21] 。CNK1蛋白参与AT2受体介导的信号转导通路[22] 。本研究结果提示：PD123319阻断AT2受体后，64个基因表达差异(AngⅡ+ PD123319组与AngⅡ组比较)，11条信号途径全部活化(cAMP/PKA、 Ca2+、PKC、PLC、PTK, MAPK、PI-3K、NO-cGMP、Rho、NF-κB、JAK-STAT通路)。其中 PI-3K通路：Pik3cg (278倍), Cflar (53倍), Bcl21 (31倍); NF-kB 通路：Agt (162倍)，Il4 (28倍); JAK-STAT通路：Cdkn1a (90倍)。该结果表明AT2 受体在CF的信号转导机制较为复杂，涉及多条信号转导通路。其中三条途径活化程度明显高于其他 途径。Nouet等报道AT2受体通过ATIP1蛋白，抑制其他酪氨酸蛋白激酶受体，呈现出AT2受体与酪 氨酸蛋白激酶受体的负性交互作用，从而抑制细胞生长 [23]。Horiuchi等报道AT2受体通过活化磷酸酶与其他G蛋白耦联受体的信号产生交互作用 [19]。本研究结果提示AT2受体阻断同时调节了其他多种G 蛋白耦联受体(Adrb1、Adrb2、Agtrl1、Calcr、Drd5、Edg1、Edg7、Ghrhr、Gnaq、Grm8、 Gprc2a、Grm5、Grm6、Lhcgr、Arrb2、Mgr8、Oprd1、Oprk1、Tshr)的表达，其详细的作用机制 有待进一步研究。
研究表明，losartan改善心肌缺血后的心肌结构和功能、减轻左室重构的主要机制，与其在阻断 AT1受体的同时使心肌组织中AngⅡ水平反应性增高，刺激AT2受体的表达相关。在此基础上AT2 受体的作用机制不明。losartan阻断AT1受体，会使更多游离的AngⅡ与AT2受体结合，使AT2受体的作用加强。我们的研究表明losartan阻断CFs的AT1受体后，高水平的AngⅡ可诱导AT2受体蛋白 高表达(机制有待进一步研究)，AT2受体在蛋白质水平高表达将使AT2受体的作用加强。本研究在阻 断AT1受体的同时阻断AT2受体，对信号转导相关基因表达谱进行研究，探求AT2受体的作用机制。 结果表明在AT1受体阻断的基础上再阻断AT2受体后，CFs的46个基因表达差异在2倍以上(AngⅡ+ losartan + PD123319组与AngⅡ+ losartan组比较)，11条信号途径全部活化。这一结果与单独阻断AT2 受体信号途径基本一致。说明AT2受体活化后的信号转导途径并不象多数文献报道的集中在NO-cGMP 途径，而是多条信号途径的活化。
有报道在新生大鼠CFs存在RAS的各个组分，AngⅡ负性调控angiotensinogen的表达，且这一作用是AT1受体依赖性的[24]。有研究报道AT2受体负性调控RAS，抑制肾素的合成及AngⅡ的形成[25]。我们的研究表明，在基因水平losartan上调angioten-sinogen的表达1.367倍，PD123319下调angioten-sinogen的表达162.63倍，说明AT2受体明显参与 angiotensinogen表达调控。但是基因水平的表达并不能完全代表蛋白质水平的表达，在蛋白质水平 AT2受体是否参与angiotensinogen的表达有待进一步研究。
研究显示CF能分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子[26]。IL-1β能减少胶原合成及提高MMP(matrix metalloproteinase)活性，从而调节CFs的胶原代谢[227]。在成年大鼠CFs，IL-1β通过不同的机制增加MMP2和MMP9的表达与活性 [28]。有报道IL-1β剂量依赖性地刺激大鼠CFs分泌整合素(fibronectin, FN)参与间质重塑[29]。IL-1β比TNF-α更快地使CFs上调AT1的表达而参与心肌间质重塑[32,33]。本研究 RT-PCR与芯片的结果都表明阻断AT1受体下调IL-1b的表达，阻断AT2受体上调IL-1β的表达。表明AT2受体在IL-1β的表达上与AT1受体起着不同 的作用。
有研究报道AngⅡ和机械压力能诱导CFs分泌TNF-α[30]。Sarkar等报道TNF-β可直接作用于成纤维细胞，导致胶原纤维的合成分泌增多[331]。有研究表明TNF-α和 IL-1β在CFs上调AT1受体的表达而参与心肌间质重塑[32,33] 。压力超负荷下的左室心肌局部TNF-a表达异常增高，这可能与胶原增生、心 室重构及心功能的损害有关；losartan可能通过抑制TNF-α 的过度表达从而减轻压力负荷下心室肌的胶原增生、心室重构及心功能的损害。本研究RT- PCR与芯片的结果都表明：阻断AT1受体下调TNF-α的表达，阻断AT2受体同样下调TNF- a的表达。该结果表明在调节TNF-α的表达上，AT2与AT1受体起着相同的作用。
我们的研究表明AT2受体不仅在结构上、作用上与AT1受体不同，AT2受体的信号转导通路与 AT1受体比较明显不同。对单一途径的深入研究将是下一步工作的重点。IL-1 β和TNF-α是参与心肌间质重塑的两个重要细胞因子，本研究RT-PCR与芯片的结果都表明，AT2受体参与两者的表达调控。
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