研究论文
产前应激子代大鼠海马核转录因子-κB表达的性别差异
李 晖1,2，朱忠良3，贾 宁3，白转丽3，蔡 青3，陈 蕊2，宋天保1,*，刘健康4,5
西安交通大学医学院1人体解剖学与组织胚胎学系； 2第一附属医院儿科；3生理学与病理生理学系，西安710061； 4中国科学院上海生命科学研究院营养研究所，上海200031；5美国加利福尼亚州立大学尔湾分校脑衰老研究所，尔湾，加利福尼亚 92796
摘 要：本研究采用免疫组织化学和Western blot检测NF-κB p65/p50在产前应激子代海马的表达，并探讨其表达是否存 在性别差异。研究结果显示，在雌性子代，中、晚期应激组海马齿状回p65表达显著低于对照组(P<0.01)，而海马各区p50表达均显著高于对照组(P<0.01)，中、晚期应激组间p65和p50表达均有显著差异(P<0.01)。在雄性子代，中、晚期应激组海马齿状回p65表达显著高于对照组(P<0.01)，晚期应激组海马各区p50表达均显著低于对照组(P<0.05, P<0.01)，中、晚期应激组间p65和p50表达均有显著差异(P<0.01)。雌、雄子代比较，对照组雌、雄p65表达差异极显著(P<0.01)，p50仅在海马CA1区表达差异极显著(P<0.01);中期应激组雌、雄子代大鼠海马p65/p50表达无显著差异；晚期应激组雌、雄海马p65/p50表达均有极显著差异(P<0.01)。Western blot与免疫组织化学结果基本一致。结果表明，产前不同时期的应激显著影响子代海马NF-κB p65和p50表达，且有性别差异，这可能是产前应激对子代雌、雄大鼠学习记忆能力影响 差异的机制之一。
关键词：核转录因子-κB；产前应激；性别差异；海马
中图分类号：R338
Gender-dependent difference of NF-κB expression in the hippocampus of prenatally stressed offspring rats
LI Hui1,2, ZHU Zhong-Liang3, JIA Ning3, BAI Zhuan-Li3, CAI Qing3, CHEN Rui2, SONG Tian-Bao1,*, LIU Jian-Kang4,5
1Department of Human Anatomy and Histology-Embryology; 2Department of Pediatrics of First Affiliated Hospital; 3Department of Physiology and Pathophysiology, School of Medicine, Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China; 4Institute for Nutritional Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China; 5Institute for Brain Aging, University of California, Irvine, CA 92796, USA
Abstract: In this study, immunohistochemistry and Western blot were used to determine whether the expression of NF-κB in the hippocampus of prenatally stressed offspring rats is gender-dependent. The results were as follows: In the female offspring rats, the expressions of p65 in the hippocampal dentate gyrus in mid-term stress (MS) and late-term stress (LS) groups were significantly less than that in the control group (P<0.01). There was a significant difference between MS and LS groups (P<0.01). The expressions of p50 in all regions of hippocampus in MS and LS groups were significantly more than that in the control group (P<0.01). A significant difference was also present between MS and LS groups (P<0.01). In the male offspring rats, the expressions of p65 in the hippocampal dentate gyrus in MS and LS groups were evidently more than that in the control group (P<0.01). There was a significant difference between MS and LS groups (P<0.01). The expressions of p50 in all regions of hippocampus in MS and LS groups were significantly less than that in the control group (P<0.05, P<0.01). There was also a significant difference in p65 expression between MS and LS groups (P<0.01). In addition, in the control group the expressions of p65 in the hippocampal dentate gyrus of female offspring rats were significantly more than that of male ones (P<0.01). However, in LS group the expressions of p65 in the hippocampal dentate gyrus of female offspring rats were significantly less than that of male ones (P<0.01). Moreover, there was no significant difference in p65 expression between female and male offspring rats in MS group. In the control group the gender difference in the expression of p50 was only observed in hippocampal CA1 (P<0.01). The expressions of p50 in all regions of hippocampus of female offspring rats were significantly more than that of male ones in LS group (P<0.01). There was no significant difference in p50 expression between female and male offspring rats in MS group. The results of Western blot were similar to those of immunohistochemical study. These results indicate that prenatal stress in different gestational periods significantly affects the expressions of p65 and p50 in hippocampus, and this effect is gender-dependent. This may be one of the mechanisms underlying the gender difference in the ability of learning and memory of the prenatally stressed offspring rats.
Key words: NF-κB; prenatal stress; sexual distinction; hippocampus
海马是学习与记忆功能的重要脑区，又是调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的高位中枢，同时也是应激累及的敏感部位。在Rattner等首次报道了神经元中存在核转录因子 κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)后[1]，相继在海马、突触和突触后致密层内发现可 诱导活性的NF-κB。因NF-κB是一种氧化应激反应性转录因子，故推测NF- kB可能起到将突触信息输送至核的信使作用[2,3]，参与了这些部位的抗氧化调节[4]。我们前期的研究发现，应激组雌性子代空间 学习与记忆能力较对照组下降[5]，同时还发现海马 CA3区细胞内Ca2+和反应性氧化产物(reactive oxygen species, ROS)浓度明显升高，而雄性子鼠无明显变化[6]。提示产前应激造成雌、雄子代学习能力差异与其引起的海马的氧化损伤有关，但其内在信 号转导机制不甚明了。因此，本研究在产前应激模型的基础上，观察海马NF-κB的p65和p50两个亚基表达的变化，来探讨产前应激致子代学习记忆能 力变化的机制，阐明NF-κB在产前应激子代中的调控作用及其性别差异，为研究胚胎脑发育关键时期 外界环境因素对脑神经细胞发育影响的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物及实验分组 实验用Sprague-Dawley大鼠。成年雌性大鼠(230~250 g)与成年雄性大鼠晚8:00合笼，次日晨7:00进行阴道涂片，精子阳性则定为妊娠第0天。受孕雌鼠单笼喂养。实验分3 组：对照组(control, CON, n=8)，孕期不给任何干预；中期应激组(mid-term stress, MS, n=8)，妊娠第7~13天给予束缚应激；晚期应激组(late-term stress, LS, n=8)，妊娠第14~20天给予束缚应激。所有动物饲养在温度22℃、湿度60%、12 h光/12 h暗循环(早8:00开灯，晚8:00关灯)的动物房中，自由饮水、饮食。实验动物由西安交通大学医学院 实验动物中心提供，并按该中心的管理规定饲养动物。
1.2 模型建立 束缚应激每天3次，每次45 min。为防止动物的习惯化，每天可在一定的时间范围内随机调整束缚应激的给予时间(8:00~11:00，11:00~14:00，16:00~19:00)。束缚在一个透明的塑料圆柱形装置(内径6 cm)中进行，装置两端留有通风口，一端固定，另一端可根据动物的大小适当调节长短。子鼠21d断奶，1月龄进行实验。选取每窝6~12只的子鼠，每窝取同性别的子鼠最多2只。
1.3 实验方法
1.3.1 ABC免疫组织化学方法观察NF-κB在海马各亚区的表达 各组取出生后30 d子鼠，经腹腔麻醉，4%多聚甲醛溶液经心脏灌流固定，取脑，浸入4℃固定液24 h，再入蔗糖溶液24~48 h，将脑组织修块，进行冰冻切片，冠状位连续切片，片厚40 μm，片间隔120 μm。分别用抗p50、p65的抗体(兔抗鼠抗p50单克隆抗体，Santa Cruz Corp.，稀释浓度1:500；兔抗鼠抗p65单克隆抗体，Santa Cruz Corp.，稀释浓度1:1 000)，按试剂盒说明进行ABC免疫组织化学染色。用抗体稀释液替代 第一抗体，进行阴性对照。每组取8只动物，每只动物取8张脑组织切片，用Olympus (B×40)生物显微镜在放大40倍视野下进行计数。记录每张脑片双侧海马各个亚区在1.08×104 μm2面积中的阳性细胞灰度值。
1.3.2 Western blot方法检测子鼠海马NF-κB蛋白的表达 各组取出生后30 d子鼠海马，每克组织加入10 ml匀浆缓冲液，玻璃匀浆器匀浆，破坏细胞膜和核膜后，进行核蛋白抽提，4℃，15 500 r/min 离心30 min后收集上清，运用Bradford法进行蛋白含量测定，保存于 -85℃备用。取样品加等体积的2×电泳样品缓冲液混合，以80 μg蛋白上样，进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，半干法转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭后，先后 加入一抗(同免疫组织化学)及二抗(碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG，美国Chemicon公司)。以β-actin做为内对照(兔抗鼠抗β-actin单克隆抗体，Santa Cruz Corp.，稀释浓度1:500)，步骤同上。利用GIS-120D数码凝胶图像分析系统，对反应条带进行半定量分析，记录所测的光密度值(optical density, OD)。以p65或p50与同组β-actin 的OD比值表示p65或p50的相对表达量。
1.4 统计学分析 所得数据以mean±SD表示，采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和Tukey post hoc检验、独立样本t检验，显著性水平为P<0.05。
2 结果
2.1 免疫组织化学结果
2.1.1 NF-κB p65的表达
NF-κB p65仅在各组子鼠海马齿状回(dentate gyrus, DG)颗粒细胞表达，其免疫反应产物为棕色颗粒或点状(图1)。
雌性子代：中、晚期应激组DG区的阳性细胞染色较对照组明显减弱。统计分析表明，中、晚 期应激组p65相对表达量比对照组显著降低(P<0.01)，中、晚期应激组间差异极显著(P<0.01)(表1)。
雄性子代：中、晚期应激组DG区的阳性细胞表达较对照组明显增多。统计分析表明，中、晚 期应激组p65相对表达量比对照组显著增高(P<0.01)，中、晚期应激组间差异极显著(P<0.01)。
雌、雄子代比较：对照组雌性DG区的阳性细胞表达比雄性明显多，有显著差异 (P<0.01)。中期应激组雌、雄无显著差异。晚期应激组雌、雄p65表达与对照组相反，并且差异极显著(P<0.01)。
2.1.2 NF-κB p50的表达
p50与p65表达明显不同的是，在各组子鼠海马CA1、CA2 、CA3、CA4及DG区均有p50 表达(图2)。
雌性子代：中、晚期应激组海马各区的阳性棕色颗粒较对照组增多。统计分析表明，中、晚期 应激组p50相对表达量比对照组显著增高(P<0.01)，中、晚期应激组间差异极显著(P<0.01)(表2)。
雄性子代：晚期应激组海马各区的阳性棕色颗粒较对照组稀疏，中期与对照组无显著差 异(P>0.05)，中、晚期应激组间差异极显著(P<0.01)。
雌、雄子代比较：对照组雌、雄子代p50仅在海马CA1区表达差异极显著 (P<0.01)，其余各区无显著差异；中期应激组雌、雄无明显差异。晚期应激组雌、雄海马各亚区p50表达均有极显著差异(P<0.01)。
2.2 Western blot结果
2.2.1 NF-κB p65的表达
雌性子代：对照组、中期应激组、晚期应激组海马NF-κB p65蛋白表达逐渐减少(图3)。统计学分析显示，中、晚期应激组与对照组有显著差异(P<0.05)，中、晚期应激组间也有显著差异(P<0.05)(图4)。
雄性子代：对照组、中期应激组、晚期应激组海马NF-κB p65蛋白表达逐渐增加(图3)。统计学分析显示，中、晚期应激组与对照组有显著差异，分别为P<0.05和P<0.01，中、晚期应激组间也有 显著差异(P<0.05)(图4)。
雌、雄子代比较：对照组雌性p65表达比雄性极显著增高(P<0.01)。中期应激雌、雄组间无明显差异。晚期应激雌、雄组表达与对照组相反，两组间比较差异极显著(P<0.01)。
2.2.2 NF-κB p50的表达
雌性子代：对照组、中期应激、晚期应激组海马p50蛋白表达逐渐增加 (图5)。统计学分析显示，中、晚期应激组与对照组间差异极显著 (P<0.01)，中、晚期应激组间无明显差异(图6)。
雄性子代：对照组、中期应激、晚期应激组海马p50蛋白表达逐渐降低 (图5)。统计学分析显示，晚期应激组与对照组有显著差异 (P<0.05)，而其它组间无明显差异(图6)。
雌、雄子代比较：对照组雌、雄无显著差异。中期应激组雌、雄之间和晚期应激组雌、雄之间均 有显著差异(P<0.01)。
3 讨论
NF-κB是存在于细胞质中的一种多向性转录调节蛋白。有研究提出，在神经细胞中适度的NF-κB活性可保护神经细胞免于氧化应激，而在小胶质细胞中 NF-κB的过度活化又可导致炎症级联反应[7]。 但更多的实验研究证明活化的NF-κB具有抗凋亡作用[8,9] ，其在中枢神经系统中的双重作用可能因细胞的激活和代谢状态不同而出现不同的结果[10]。
免疫组化结果显示，产前应激子代NF-κB的p65和p50亚基在海马表达分布特点不同：p50在子代海马各个亚区均有表达，p65仅在海马DG表达。正常情况下，p65亚基表达存在着性别差异，雌性高于雄性，而雌、雄p50 表达仅在海马CA1区有差异。有研究认为这种性别差异与大脑半球发育早期性腺激素的组织性导致的形态和活动的性别差异有类似之处[11]。同时，免疫组化及Western blot结果均显示，中、晚期应激组雌性子鼠海马p65表达降低，p50表达升高，而雄性子代p65表达升高，p50表达降低，实验组雌、雄差异显著。有兴趣的是结合我们用相同动物模型观察不同时期产前应激对雌、雄子代空间学习和记忆能力影响的行为学 实验结果[5]，空间学习和记忆能力下降的雌性子代，p65表达降低，p50表达升高；空间学习和记忆能力下降不明显的雄性子代，p65表达升高，p50表达降低，提示NF-κB p65/p50不仅仅是参与学习记忆信号转导过程中的一个重要信号转录因子，而 且与产前应激对子代雌、雄大鼠行为学影响的差异有一定的内在联系。
NF-κB通常由p50/p65异源二聚体与其抑制物IκB (inhibitory kappaB)结合形成三聚体，在静息状态下，以失活形式存在于细胞质中。当机体受到外界因素刺激时，IκB从NF-κB二聚体上解离并降解，游离的p50/p65二聚体移位进入细胞核。因p65亚基有转录激活区可与靶基因启动子区域的κB位点结合，调节靶基因的表达，参与机体正常的发育、细胞生长和凋亡[11,12]; p50亚基无转录激活区，故通常认为其无转录活性，但能与 p65亚基竞争结合kB序列，起到抑制作用，但其在组织发育中的作用研 究较少。
我们前期研究发现，中、晚期应激组中，雌性子鼠海马神经元数量明显少于雄性子鼠；雌性子 鼠海马CA1和CA3区神经元超微结构表现出明显较严重的线粒体肿胀及出现较多的脂褐素；雌性子鼠海马神经型一氧化氮合酶(nNOS)的阳性表达量比雄性子代高[13]。这表明产前应激对子代脑组织形态学的影响存在性别差异，产前应激对雌性的影响更加敏感，其内在分子机制尚不明了。结合本实验结果，认为在孕期应激条件下，NF-κB p65的激活可能对产前应激子代海马的氧化损伤有保护作用，NF-κB p50的激活却对此有抑制作用，这种抑制作用可能是抑制NF-κB p65活化的结果[14]。有资料报道，严重的孕晚期应激，干扰下丘脑视前区性别异形性核、室周前腹侧核的发育[15]，特别是对雄性子代。因为大鼠的性别分化发生在胚胎最后几天，雄性鼠脑的雄性化的发育有赖于孕 18和19 d重要脑区内适当的睾酮水平和芳香化酶活性[16,17]。若睾酮水平不足，芳香化酶将睾酮转变成雌二醇，引起雄性 子鼠的下丘脑视前区性别异形性核减小，室周前腹侧核增大。这些变化使雄性脑结构与雌性更加相似[118]，雄性子鼠产生了去雄化影响。因此，研究结果显示产前不同时期应激以晚期应激组雌性子代海马细胞损伤明显，可能与 NF-κB p65表达有关。
NF-κB p65表达增高时，抗氧化体系中的钙结合蛋白及Mn-SOD等相关转录基因表达增加[19,20]，致机体抗氧化功能增强，神经细胞发生可塑性代偿 维持细胞的正常结构和功能；当p65表达低时，钙结合蛋白及Mn-SOD等相关转录基因表达减弱，致 机体处于氧化-还原失衡状态，引起海马细胞的氧化损伤。本研究结果提示，NF-κB可能是参与学习记忆信号转导过程中的一个重要转录因子，至于在 信号转导过程中激活哪些蛋白激酶，作用于哪些受体是我们下一步研究的方向。
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