研究论文
凋亡诱导因子介导缺氧/复氧致肥大心肌细胞凋亡的作用
冯 兵*，周小波，杨 旭，叶自林，何作云
第三军医大学新桥医院肾内科，重庆 400037
摘 要：心肌细胞凋亡导致心肌组织合胞体功能丧失，最终使代偿性心肌肥大向心力衰竭转化。过去的研究已经确认天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspartate-specific cysteinyl proteinase, caspase) 依赖机制在心肌细胞凋亡中的作用，但对caspase非依赖机制即凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)在心肌细胞凋亡中的作用尚不明确。本研究应用血管紧张素Ⅱ(0.1 μmol/L培养12 h)诱导培养的小鼠肥大心肌细胞，利用三气孵箱建立缺氧/复氧模型以模拟缺血再灌注。应用RT-PCR、Western blot、siRNA基因转染、Hoechst 33258染色法检测AIF在mRNA和蛋白质水平的表达及细胞凋亡的变化，分析AIF在缺氧/复氧致肥大心肌细胞凋亡中的意义。结果如下：(1)与对照组比较，缺氧8 h组(H8h)和缺氧12 h组(H12h)AIF mRNA及蛋白表达水平均显著升高(mRNA：0.52±0.04及0.85±0.10vs 0.29±0.08，P<0.05；蛋白质：2.07±0.15和3.12±0.19 vs 0.29?.04，P<0.05)，即随缺血时间的延长， AIF mRNA及蛋白表达水平均显著增加。(2) 与对应单纯缺氧组比较，缺氧后给予复氧刺激，H8h/R组和H12h/R组AIF mRNA及蛋白表达水平均显著升高(mRNA：1.09±0.12和1.41±0.23，P<0.05；蛋白质：4.57±0.25和5.71±0.27， P<0.05)。仅在H8h/R及H12h/R组，可见AIF核转位显著增加。(3)AIF siRNA转染可显著抑制肥大心肌细胞AIF的表达，对缺氧时细胞凋亡无明显影响 (P>0.05)，但可显著降低缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞 凋亡率(P<0.05)。同时抑制AIF及caspase-3活性，可显著加强单一抑制剂对缺氧 /复氧诱导的肥大心肌细胞凋亡的抑制作用。(4) 抑制caspase-3活性对缺氧/复氧诱导的AIF核转位无明显影响。上述结果提示，缺氧 /复氧时AIF mRNA、蛋白表达和核转位均显著增加，且在缺氧/复氧诱导肥大心肌细胞凋亡中具有重要的作用。
关键词：心肌肥大；细胞凋亡；缺氧/复氧；凋亡诱导因子
中图分类号：Q463；Q256；R363
Apoptosis of hypertrophic cardiomyocytes stimulated by hypoxia-reoxygenation is partially mediated by apoptosis-inducing factor
FENG Bing*, ZHOU Xiao-Bo, YANG Xu, YE Zi-Ling, HE Zuo-Yun
Department of Nephrology, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037, China
Abstract: Cardiomyocyte apoptosis leads to the functional incapacitation of myocardial plasmodium and plays an important role in the pathogenesis of heart failure transformed from compensable cardiac hypertrophy. Mitochondria are the main source of apoptosis-inducing molecule of various cells, and the role of caspartate-specific cysteinyl proteinase (caspase)-dependent mechanism has generally been accepted in the cardiomyocyte apoptosis. However, the significance of caspase-independent apoptosis-inducing factor (AIF) mechanism is not yet understood. The purpose of this study was to evaluate hypoxia-reperfusion-induced alterations of AIF mRNA and protein expressions in hypertrophic cardiomyocytes. Cardiomyocyte hypertrophy was produced by angiotensin II (0.1 μmol/L). The cells were cultured under the condition of hypoxia (95% N2 and 5% CO2; the O2 partial pressure was lower than 5 mmHg) for 8 h or 12 h (named as H8h and H12h groups, respectively), and then exposed to normal culture environment (named as H8h/R and H12h/R groups, respectively). Apoptosis was detected with Hoechst 33258 staining. The AIF mRNA and protein expressions were detected by RT-PCR and Western blot and quantified by gel scanning. The results were as follows: (1) The level of AIF mRNA expression was 0.29±0.08 (optical density, relative value) in the control group (hypertrophic cardiomyocytes cultured in normal environment). Compared with that in the control group, the levels of AIF mRNA expression were significantly higher in the groups of H8h and H12h (0.52±0.04 and 0.85±0.10), indicating that this effect was time-dependent. A further increase of AIF mRNA expression was observed in the groups of H8h/R (1.09±0.12) and H12h/R (1.41±0.23). (2) The level of AIF protein expression was 0.29±0.04 in the control group. Compared with that in the control group, the levels of AIF protein expression were significantly higher in the groups of H8h and H12h (2.07±0.15 and 3.12±0.19). The AIF protein expression was increased further in the groups of H8h/R (4.57±0.25) and H12h/R (5.71±0.27). The nuclear translocation of AIF protein was obvious only in the groups of H8h/R and H12h/R. (3) The expressions of AIF mRNA and protein were almost completely inhibited by AIF siRNA transfection. The siRNA transfection also reduced the apoptosis of hypertrophic cardiomyocytes in the groups of H8h/R and H12h/R but not in the groups of H8h and H12h. The apoptosis rate was significantly reduced by both AIF siRNA transfection and Ac-DEVD-cmk, an inhibitor of caspase-3. This reduction induced by two factors was more evident than that by one factor. (4) AIF nuclear translocation induced by hypoxia-reperfusion was not affected by inhibition of the activity of caspase-3. These data suggest that AIF plays a pivotal role in the apoptosis of hypertrophic cardiomyocytes induced by hypoxia-reperfusion.
Key words: cardiac hypertrophy; apoptosis; hypoxia-reoxygenation; apoptosis-inducing factor
心肌细胞凋亡是各种病因所致心室肌重构的重要中间环节，可能在心肌肥大向心力衰竭转化的过程中具有重要作用[1-4]。氧自由基是引起细胞凋亡的直接的和最重要的启动分子，缺血再灌注又是最常见的导致心肌细胞氧化损伤的临床病因。与正常心肌 细胞相比，肥厚心肌更易于受到缺血再灌注的损伤。因此，阐明心肌细胞凋亡的信号转导机制，可为寻找防治心肌肥大转化为心力衰竭的药物靶点提供理论依据。心肌细胞能量需求大，而且主要依赖有氧代谢，因此极易受到缺氧/复氧损伤。线粒体作为能量工厂，还具有启动细胞自杀即细胞凋亡的功 能，因此，线粒体死亡途径在心肌细胞凋亡机制中具有更为特殊的意义。
大量研究表明，多种病理因子可通过刺激线粒体释放细胞色素C、诱导天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspartate-specific cysteinyl proteinase, caspase) 活化导致细胞凋亡；相反，抑制caspase活化可显著降低细胞凋亡率。因此，细胞色素 C-caspase途径被认为是细胞凋亡的主要信号转导通路。有实验发现，细胞内还存在一类叫凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)的信号转导蛋白，分布于细胞线粒体膜间隙中。当受到病理因素刺激 时，该信号蛋白被释放到胞浆中，并转位进入细胞核内诱导 DNA断裂和细胞凋亡，因此被认为是caspase非依赖细胞凋亡信号转导机制中的重要分子。动物实验结果表明，直接抑制caspase活性并不显著降低心肌缺血引起的梗死面积[5,6]，提示缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡至少是不完全依赖于caspase的，推测可能与AIF途径有关。然而，AIF凋亡信号途径在心肌细胞凋亡中的变化及意义罕见报道[7]。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 VS5060UV型CO2培养箱和BB6220型三气培养箱由德国Heraeus生产，BX60型 倒置光学显微镜及显微照像系统由德国Leica公司生产，BX60型荧光显微镜由日本Olympus公司生产。RT-PCR kit(AMV)ver.3.0 由日本TaKaRa提供，Hoechst 33258细胞凋亡检测试剂盒(Sigma分装)由碧云天试剂公司提供，caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit 由美国BioVision公司提供，Ac-DEVD-cmk由美国Calbiochem公司提供，siRNA基因转染试剂盒由美国Santa Cruz公司提供。2~3 d新生的昆明系小鼠由第三军医大学动物实验中心提供。
1.2 小鼠心肌细胞培养 参考Kariner等[8]报道的方法，取出生2 d内昆明系小鼠(雌雄不限)，在75%酒精中消毒2 min，无菌取出心脏，迅速放入4℃预冷的D-Hanks缓冲液中，冲洗残留的血液。 剪去心包膜等纤维组织、大血管和心房，用D-Hanks液轻轻冲洗心室组织，剪碎成1 mm×1 mm1× mm大小后再次用D-Hanks冲洗一次，加入3 ml 0.125%胰酶消化液，37℃温浴5 min，轻轻吹打组织块，使松弛的细胞尽可能从组织块中脱落下来。把细胞 悬液吸入培养瓶中，向培养瓶中加入含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培养基终止胰酶反应。重复上述消化过程5~8 次(弃去首次收集的细胞悬液)。收集消化后的细胞悬液用100 目滤网过滤后，于800 g离心7 min，弃上清，加入含10% FBS的DMEM/F12培养液将细胞沉淀混悬，37℃，5% CO2孵箱培养培养2 h，利用差速贴壁技术，收集主要含有心肌细胞的上清悬液，记数后按1×106个/ml转种在无菌培养板上，并加入终浓度为25μmol/L的阿糖胞苷(cytosine arabinoside, Ara-C)抑制成纤维细胞的生长，37℃，5% CO2 孵箱培养24 h后更换培养基以去除Ara-C，以后每2~3 d换液一次。
1.3 心肌细胞肥大的诱导和缺氧/复氧模型的建立 心肌细胞肥大的诱导参照詹昌德等[9]介绍的方法：向培养基中加入终浓度为0.1 μmol/L血管紧张素Ⅱ培养12 h，即形成肥大心肌细胞。模拟缺血再灌注的缺氧/复氧模型：参照 Chen等[10]建立的方法，将培养的肥大心肌细胞放入三气孵箱中，持续给95% N2和5% CO2，控制氧分压在5 mmHg以下即为缺氧模型，恢复常态培养即为复氧模型。按实验设计要求进行不同时间的缺氧、复氧培养。
1.4 实验分组 实验共分为7组，即肥大对照组(hypertrophy control, HC)、缺氧8 h组(H8h)、缺氧12 h组(H12h)、缺氧8 h/复氧4 h组(H8h/R)、缺氧12 h/复氧4 h组(H12h/R)、缺氧12 h+siRNA基因转染组(H12h+AIF siRNA)、缺氧12 h/复氧4 h+siRNA基因转染组(H12h/R + AIF siRNA)。
1.5 RT-PCR法测定AIF mRNA的表达 常规方法提取各实验组肥大心肌细胞总RNA后，以RT- PCR法检测AIF在mRNA水平的表达。β-actin cDNA上游引物：5'-GCTACAGCTTCACCACCACAG-3'，下游引物：5'-GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3',长度为291 bp，退火温度为58℃。AIF cDNA[11]上游引物：5'-CAAGACTGGCGGACTGGAAATAGA-3'，下游引物：5'-AGGGGCGCTGGGAGGAAT-3'，长度为424 bp，退火温度为58℃。按如下条件进行逆转录反应：30℃ 100 min；50℃ 30 min；99℃ 5 min；5℃ 5 min。按如下条件进行PCR反应：94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。将PCR产物进行1.8%琼脂糖电泳，凝胶成像分析仪中扫描， 并测定电泳条带的光密度值(optical density, OD)，目的基因mRNA的相对表达量以目的片段与相应 b-actin 的OD比值表示。
1.6 Western blot法检测心肌细胞AIF蛋白表达及核转位 细胞核蛋白提取[12]：以0.01 mol/L PBS清洗细胞三次，每孔加入1 ml 0.125%胰酶进行消化，1 500 r/min离心10 min，弃上清，以PBS清洗细胞沉淀两次，加入2 ml 缓冲液B (0.1 mol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 mmol/L PMSF)，冰上放置10 min，玻璃匀浆器匀浆约40次使大部分细胞破碎，吸取匀浆液置离心管中，1 000 g离心3 min，沉淀(细胞核部分)用缓冲液B冲洗两次后加入0.5 ml溶解备用。
1.7 转染AIF siRNA对肥大心肌细胞凋亡的影响 AIF siRNA转染方法：以1×106个/ml将心肌细胞接种在六孔培养板中，诱导心肌细胞肥大成功后，按照Santa cruz提供的“siRNA protocol”步骤同时进行AIF siRNA和绿色荧光标记的对照siRNA转染，转染后细胞放入37℃孵箱中继续培养30 h。转染效率检测：荧光显微镜下观察绿色荧光标记的对照siRNA转染情况(绿色荧光为阳性信号)。为便于计数，将对照转染细胞进行Hoechst33258染色，所有细胞核均可被染成蓝色。随机观察3个视野 (×200)，共计数600个细胞，转染效率可达95%。同时应用Western blot法及RT-PCR法检测AIF蛋白及mRNA的表达情况，以确认转染AIF siRNA所引起的基因沉默作用。
1.8 Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡 参考Dai等[12]报道的方法，吸弃培养液，加入0.5 ml固定液固定10 min后，以0.01 mol/L PBS清洗细胞2次，每次3 min。避光条件下加入0.5 ml Hoechst 33258 (5 mg/ml)染色5 min，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察(激发光和发射光波长分别为365 nm和420 nm)。正常细胞核为圆形，淡蓝色；凋亡细胞的核由于染色质浓集而呈现亮蓝色，核呈分叶、碎片状等。
1.9 统计学方法 结果以mean±SD表示，以SPSS l0.0统计软件包进行统计学处理，应用one-samples T-Test分析或one-way ANOVA分析，P<0.05为具有统计学差异。
2 结果
2.1 AIF siRNA转染对肥大心肌细胞AIF基因表达的影响
我们应用含绿色荧光蛋白的载体作对照转染，发现肥大心肌细胞基因转染率可达到 95%。以AIF siRNA转染肥大心肌细胞，并于24 h、48 h后分别检测AIF mRNA及蛋白的表达，结果发现AIFmRNA表达显著降低，分别下降(91.6±5.9)%和(94.1±2.9)%(图1)，蛋白表达抑制率分别为(88.4±4.5)%和(93.7±3.3)%(图2)。提示AIF siRNA转染可显著抑制AIF在mRNA及蛋白水平的表达。
2.2 缺氧或缺氧/复氧时肥大心肌细胞AIF mRNA表达的变化
与对照组相比，缺氧8 h组(H8h)及12 h组(H12h) AIF mRNA表达水平均显著增高(0.52±0.04和0.85±0.10 vs 0.29±0.08，P<0.05)。结果提示缺氧可显著激活肥大心肌细胞AIF mRNA的表达，且随缺血时间的延长，AIF mRNA表达增加更为明显。缺氧后给予复氧刺激，发现AIF mRNA的表达水平比单纯缺氧时进一步显著上升(P<0.05) (图3、4)。
2.3 缺氧或缺氧/复氧时肥大心肌细胞AIF蛋白表达变化及核转位
单纯缺氧8 h即可诱导肥大心肌细胞AIF蛋白表达显著升高，且该表达随缺氧时间的延长而增加(缺氧12 h显著高于缺氧8 h组，P<0.05)。缺氧后给予复氧刺激时，AIF蛋白的表达显著高于单纯 缺氧的对应时间组(P<0.05)(图5)。正常情况下，AIF蛋白分布于线粒体膜间隙中，本研究发现，在单纯缺氧8 h、12 h(H8h，H12h组)的肥大心肌细胞细胞核中没有出现AIF，而缺氧8 h、12 h再复氧刺激4 h (H8h/R及H12h/R组)后，细胞核中AIF含量显著增加(图6)。说明单纯缺氧时肥大心肌细胞中虽然AIF表达总量增加了，但并未发生核转位，而缺氧/复氧时心肌细胞内AIF蛋白不但表达增加，而且从线粒体转位至细胞核。
2.4 AIF siRNA转染和/或抑制caspase-3活性对肥大心肌细胞凋亡的影响
AIF siRNA转染可显著抑制肥大心肌细胞AIF的表达，对缺氧时的细胞凋亡无明显影响，但可显著 抑制缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞的凋亡(P<0.05)，且显著高于肥大心肌细胞对照组。同时抑制AIF及caspase-3活性，可进一步加强缺氧或缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞的凋亡，提示AIF和caspase-3途径均参与了缺氧或缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞凋亡过程，而且AIF途径发挥作用较caspase途径晚，仅在复氧损伤阶段显著活化(表1)。
2.5 抑制caspase-3活性对AIF核转位的影响
为了探讨caspase与AIF途径之间是否存在相互作用，我们采用caspase抑制剂Ac-DEVD-cmk抑制 caspase-3活性，观察caspase 对缺氧或缺氧/复氧后AIF核转位的影响。实验发现，在单纯缺氧12 h时肥大心肌细胞核中并无AIF转位，而在缺氧12 h/复氧4 h时，无Ac-DEVD-cmk组AIF转位进入核内显著增加，加入Ac-DEVD-cmk对肥大心肌细胞AIF 核转位并无显著作用[1:(1.06±0.09), P>0.05]，提示AIF核转位不受caspase-3活性的影响(图7)。
3 讨论
大量研究发现，细胞凋亡广泛参与组织发生、老化组织细胞的生理性清除、组织结构重建等，它可以是机体器官发育分化的生理过程，也可以是器官组织机能失代偿后的自身破坏过程。众所周知，心肌是一个合胞体，各房室心肌细胞间通过特有的闰盘连接使所有心肌细胞成为一个心电统一体，这 样才能达到同时收缩、舒张的功能。若有心肌细胞凋亡，势必造成细胞间心电信号转导的障碍，表现 为心电不均一性所致的心律失常、心肌收缩不同步等，最终导致心功能不断下降。动物实验结果提示，压力超负荷大鼠肥大心肌细胞凋亡率显著增加。因此近年研究认为，心肌细胞凋亡是肥大心肌 失代偿后向心力衰竭转化的主要作用机制。
与正常心肌细胞比较，肥大心肌细胞在结构和功能方面均发生了显著变化，首先是肌原纤维和肌节的增多，其次是Ca2+转运蛋白包括SERCA2a、ryanodine受体等表达明显减少，三是线粒体数量极为丰富，线粒体肿胀、空泡化多见，能量代谢途 径由脂肪代谢为主向糖代谢为主等节能方向转变[13]。大量动物实验结果表明，上述肥大心肌细胞的细胞内重构不仅是细胞收缩功能减退的分子基础，也是细胞对于缺血、缺氧等病理刺激耐受性降低的重要原因。由此可见，抑制肥大心肌细胞凋亡是防治代偿性心肌肥大转化为心力衰竭的最后可行之路。
Caspase-3直接参与了染色体凝聚和DNA片段化等过程，是细胞凋亡中的关键执行者[14,15]，其在模拟缺血、缺氧诱导培养心肌细胞凋亡中的重要作用已得到实验证实[16]。caspase-3心脏特异过表达的转基因鼠可显著增加缺血再灌注后心肌细胞凋亡和心肌梗死面积[17]，抑制caspase-3活性可明显降低心肌梗死的面积[18]。本研究发现，caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-cmk可显著降低缺氧及缺氧/复氧时心肌细胞凋亡率(表1)，但仅能抑制50%左右的活性，残存的 caspase-3活性仍显著高于非缺氧/复氧对照组，说明非caspase依赖性细胞凋亡途径在缺氧或缺氧/复氧后肥大心肌细胞凋亡中同样具有重要作用。
目前，非caspase依赖性的细胞凋亡途径的作用已受到相当的重视[19,20]。许多类型的细胞都拥有除caspase以外的细胞凋亡机制，而 AIF被认为在调控caspase非依赖性细胞死亡中起中心作用[7]。AIF分布于细胞线粒体膜间隙中，当受到病理因子刺激时，该信号蛋白被释放到胞浆中，并转位进入细胞核内诱导 DNA断裂和细胞凋亡。AIF是否起作用可能与具体的细胞类型和具体的刺激信号有关。本研究结果表明，肥大心肌细胞受到缺氧刺激后，AIF mRNA和蛋白的表达均显著升高，但未出现AIF蛋白核转位现象，这可能与单纯缺氧线粒体膜损伤尚较轻、或者线粒体尚未启动AIF蛋白释放机制有关(图3、4)。在缺氧给予复氧后，AIF mRNA和蛋白的表达进一步明显上升，而且细胞核内AIF蛋白含量显著增加(图5、6)。应用siRNA技术明确抑制AIF mRNA表达，不仅显著抑制了缺氧或缺氧/复氧所致的肥大心肌细胞AIF核转位，而且使缺氧或缺氧/复氧所致的肥大心肌细胞凋亡也显著降低(表1)，说明AIF途径在缺氧或缺氧/复氧诱导肥大心肌细胞凋亡中起到了重要作用。
Caspase-3具有蛋白酶解作用，不仅可以直接诱导DNA片段化，还直接参与肌原纤维的降解[17]，因此推测caspase途径与AIF途径之间可能通过其蛋白酶解作用存在相互调节影响，本研究结果表明，抑制caspase 活性对缺氧或缺氧/复氧后AIF的表达和核转位均无显著影响，分别抑制caspase和AIF均可部分抑制缺氧或缺氧/复氧所致的肥大心肌细胞凋亡；联合抑制caspase和AIF信号，只在复氧阶段显示了相加效应，提示这两种信号途径在肥大心肌细胞凋亡机制中均起着重要作用，单独切断任何一种信号转导，均不能完全抑制细胞凋亡的发生。这一结果与最近国外的报道一致[21,22]。另有研究发 现，聚(ADP-核糖)多聚酶活化是AIF表达和从线粒体释放的调控信号。如果能进一步证实聚(ADP-核糖)多聚酶也是caspase-3的上游信号开关，那么可以认为，聚(ADP-核糖)多聚酶是启动细胞凋亡的关键分子，有可能是临床上抑制缺血再灌注所致心肌细胞凋亡的最佳药物靶位。
总之，本研究结果表明，非caspase依赖的AIF细胞凋亡信号途径在缺血再灌注诱导肥大心肌细胞凋亡机制中发挥了重要作用。临床上，必须寻找能同时抑制caspase依赖和非依赖细胞凋亡信号的作用靶点，才能达到有效防治缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。
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